半滑舌鰨aqp1aa、lipocalin基因的克隆及表達(dá)分析.pdf

1、半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)是我國北方沿海重要的咸水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類，由于個體大小存在巨大的雌雄差異，雄性個體生長緩慢，雌性個體生長速度較快，因此培育全雌性苗種對于半滑舌鰨的育種具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。半滑舌鰨的染色體類型為 ZW型，并且在自然的養(yǎng)殖環(huán)境中存在性反轉(zhuǎn)現(xiàn)象。由于半滑舌鰨的性別決定機(jī)制和性別決定基因尚不清楚，因此研究半滑舌鰨的性別相關(guān)基因?qū)τ诎牖圉嵢菩詢?yōu)良品種的選育具有至關(guān)重要的作用。本文對半滑舌鰨的

2、兩個性別相關(guān)基因進(jìn)行研究，得出以下結(jié)果：
　　AQP（Aquaporin）家族是一組跨膜水通道蛋白，其在動物體內(nèi)的主要功能是允許水分子和小分子的有機(jī)物通過細(xì)胞膜[1]。aqp1aa是第一個被發(fā)現(xiàn)的跨膜水通道蛋白,其在生物體內(nèi)的功能包括細(xì)胞遷移，脂肪代謝、機(jī)體免疫、神經(jīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等[1,2,3,4,5]。此外有研究發(fā)現(xiàn)該基因還參與了雄性的精子發(fā)生。本研究對半滑舌鰨aqp1aa基因的全長進(jìn)行了克隆，并進(jìn)行了相關(guān)的生物信息學(xué)分析，探討了半

3、滑舌鰨aqp1aa基因物種間的進(jìn)化關(guān)系以及在硬骨魚類中的保守性。半滑舌鰨aqp1aa基因全長1411bp，ORF區(qū)786 bp，共編碼261個氨基酸。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)：半滑舌鰨aqp1aa基因包含有6個跨膜α螺旋組成的疏水性通道和一個高度保守的天冬氨酸-脯氨酸-丙氨酸基序，這是水孔蛋白超家族的特異性標(biāo)簽。通過序列比對并對其進(jìn)行相應(yīng)的進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)：aqp1aa基因在硬骨魚類中是高度保守的，尤其是α螺旋和家族標(biāo)簽保守性最高。qPCR結(jié)果顯

4、示：該基因在半滑舌鰨各組織中的表達(dá)水平存在差異性，在精巢中表達(dá)最高，其次是腦，其他組織表達(dá)較低，在不同發(fā)育時期中的表達(dá)結(jié)果顯示：在105日齡時在精巢中的表達(dá)明顯，105dph到2yph表達(dá)量一直增高，在不同表型中的表達(dá)結(jié)果顯示：在雄魚和偽雄魚的精巢中 aqp1aa基因的表達(dá)量高，在雌魚z卵巢中的表達(dá)量次之，在dmrt1敲除的雄魚和三倍體雄魚中的表達(dá)量最低。通過原位雜交發(fā)現(xiàn)：aqp1aa雜交信號主要出現(xiàn)在精子細(xì)胞和精子中，在不同時期的性腺

5、的原位雜交結(jié)果與熒光定量的結(jié)果相一致，因此我們預(yù)測aqp1aa基因在半滑舌鰨精子發(fā)生過程中具有重要的功能。
　　脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（lipocalin）超家族是一類小分子的胞外分泌蛋白，這類蛋白在序列上存在很大的差異，但是在晶體結(jié)構(gòu)上高度保守，具有八個氫鍵組成的β反向平行，脂質(zhì)運(yùn)載蛋白主要是通過結(jié)合小分子來行使功能:它可以通過結(jié)合一系列的疏水性小分子或細(xì)胞表面受體形成可溶性的大分子復(fù)合物來完成其功能。本研究克隆得到了半滑舌鰨lipoca

6、lin基因的cDNA全長序列并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，探討了該基因的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點及其在物種間的進(jìn)化關(guān)系，該基因mRNA在半滑舌鰨不同組織、不同性別及不同發(fā)育時期的相對表達(dá)結(jié)果表明：lipocalin基因在半滑舌鰨卵巢中表達(dá)量最高，在免疫組織中表達(dá)量較高，在精巢中表達(dá)量較低，在105日齡的卵巢中表達(dá)量顯著升高。原位雜交結(jié)果顯示：lipocalin基因在卵巢的Ⅲ、Ⅳ卵母細(xì)胞重出現(xiàn)明顯的雜交信號。以上結(jié)果表明：lipocalin基因在卵子的