羅非魚GATA-2和P450(11β)基因克隆、表達及在性腺分化和配子發(fā)生中作用的初步研究.pdf

1、西南大學碩士學位論文羅非魚GATA2和P450（11β）基因克隆、表達及在性腺分化和配子發(fā)生中作用的初步研究姓名：張未麗申請學位級別：碩士專業(yè)：水生生物學指導(dǎo)教師：王德壽200906兩南大學碩學位論文研究。發(fā)現(xiàn)羅非魚GATA2a在腦、垂體、卵巢和鰓表達，而GH尉2b僅在垂體、卵巢和鰓表達，且兩者在性腺的表達都具有明顯的性別二態(tài)性(只在卵巢表達，而不表達于精巢)。進而，為了研究兩個G■勿2的性別二態(tài)性表達是否受到外源性激素的影響，實驗了用

2、MT(雄激素甲基睪酮)，F(xiàn)(雌激素合成酶抑制劑)，TAM(雌激素受體拮抗劑)和E2(雌激素)藥物處理羅非魚導(dǎo)致完全性逆轉(zhuǎn)，并檢測八個月大的羅非魚發(fā)現(xiàn)GATA2a和一2b都表達于性逆轉(zhuǎn)的雌魚(XY)，而在的性逆轉(zhuǎn)的雄魚(XX)中檢測不到表達，結(jié)果與對照組剛好相反。證明GATA2a和拍的表達與基因型無關(guān)，只與表型(雌性卵巢)相關(guān)。為了確定羅非魚兩個GATA2基因的細胞表達類型，用原位雜交的方法分別檢測了兩個基因在卵巢，腦和垂體中的表達，結(jié)果

3、顯示GAlA2a和一乃都表達于卵巢的顆粒細胞、鞘膜細胞和間質(zhì)細胞及腺垂體中細胞(具體細胞類型未確定)，而GATA2a還表達于腦的血細胞及血管附近的細胞。初步結(jié)果表明它們具有基本相同的組織分布和細胞表達類型，只是略有差異，暗示其功能也可能不完全一致。在多種硬骨魚類中已有的研究都證明了11酮基睪酮(1lketotestosterone，11KT)是重要的雄激素之一，而P450(1lfl)編碼的11B羥化酶是11KT合成途徑中的關(guān)鍵酶。本研究

4、從尼羅羅非魚中克隆得到了兩種選擇性剪切形式的P450(1Ifl)，分別命名為P450(1lfl)一，和2，它們的開放閱讀框分別長為1614bp和1227bp，編碼537和408個氨基酸。P450(1lfl)J基因含有9個外顯子，而與P450(1lp)J不同的是，P450“l(fā)fl)2缺乏9個外顯子中的第7和第89b顯子。通過對羅非魚和其他已知的物種的P450(1lfl)序列進行比對，發(fā)現(xiàn)羅非魚P450alfl)一J和青鯔的P450(1lf

5、l)相似性最高。組織分布結(jié)果表明，P450alfl)一l希ne都表達于雌性和雄性羅非魚的腎和頭腎，并呈性別二態(tài)性的表達于性腺(只表達于精巢，不在卵巢表達)，同時，在個檢測組織r盧P450Hlfl)2的表達量低于1450(118)一J。通過對性腺發(fā)育過程中的表達發(fā)現(xiàn)d450#lp)』和2在孵化后50天的雄性精巢開始表達，卵巢中也沒有表達。經(jīng)F、TAM和E2藥物誘導(dǎo)性逆轉(zhuǎn)后，P450alfl)J和P450(1lfl)2都強烈表達于F和TAM

6、處理后性逆轉(zhuǎn)形成的精巢(xx)，而在E2處理誘導(dǎo)性逆轉(zhuǎn)產(chǎn)生的卵巢(xY)中它們的表達被完全抑制，不能被檢測到。Northernblot分析則進一步證明在羅非魚中存在兩種選擇性剪切形式的p4so(Hp)，并呈現(xiàn)出性別二態(tài)性表達，僅在精巢中觀察到18和15kb的兩條帶對應(yīng)于P450(1lfl)J和之兩種剪切形式形成的mRNA，在卵巢和腦中沒有。原位雜交和免疫組化實驗結(jié)果表明劇jDⅣ，歷除強烈表達于精巢的Leymg細胞和頭腎腎間細胞外，還在精

7、原細胞中有微弱的表達。綜上所述，本實驗的結(jié)果表明P450(1Ip)在羅非魚中，除在頭腎中與可的松的合成有關(guān)外，還可能在精巢中通過11KT的合成對雄性精子發(fā)生中發(fā)揮重要作用。本研究從羅非魚克隆到由兩個基因編碼的GATA2，兩個GATA2都只在卵巢表達，不在精巢表達；還克隆得到兩種剪切形式的P450(1lfl)，都只在精巢表達，不在卵巢表達，而通過對性逆轉(zhuǎn)魚的檢測，發(fā)現(xiàn)它們的表達都與性腺的表型相關(guān)，與基因型無關(guān)。并且功能可能分別與性腺分化和