基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的嗜蟲書虱P450基因的克隆與表達研究.pdf

1、嗜蟲書虱Liposcelis entomophila（Enderlein）是一種重要的儲藏物害蟲，大量發(fā)生時可造成嚴重的經(jīng)濟損失，且對化學藥劑的抗性發(fā)展迅速，已引起全世界儲藏物工作者的高度重視。但與其他儲藏物類害蟲相比，關于嗜蟲書虱抗性機理的研究鮮有報道。細胞色素P450是昆蟲體內(nèi)一種重要的解毒代謝酶，在昆蟲的生命活動中具有重要的生理功能。本學位論文以嗜蟲書虱為研究對象，圍繞細胞色素P450介導昆蟲代謝抗性這一科學問題開展研究工作。具體

2、內(nèi)容包括：測定嗜蟲書虱對藥劑的敏感性，明確不同種群的抗性水平；構(gòu)建嗜蟲書虱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，篩選鑒定具有解毒代謝功能的基因信息；聚焦細胞色素P450基因，克隆cDNA全長序列，解析這些基因在不同性別、不同發(fā)育階段以及藥劑誘導后的表達模式；初步構(gòu)建嗜蟲書虱P450基因真核表達載體；從生化水平上比較相對抗性和相對敏感種群P450s的酶學特征。研究結(jié)果為探究細胞色素P450是否參與嗜蟲書虱抗藥性形成提供基礎數(shù)據(jù)，在實踐上為制定嗜蟲書虱可持續(xù)的防控

3、策略提供指導。主要研究結(jié)果如下：
　　1.嗜蟲書虱轉(zhuǎn)錄組測序及解毒代謝酶基因的鑒定
　　利用Illumina技術對嗜蟲書虱全蟲態(tài)進行轉(zhuǎn)錄組測序，通過組裝拼接獲得了54,220個Unigene，提交至Nr、Swiss-Prot、KEGG、COG、GO數(shù)據(jù)庫進行BLASTX比對，得到成功注釋的Unigene分別有33,404、25,637、23,068、11,773和19,355個；序列同源性分析結(jié)果表明，在Nr數(shù)據(jù)庫中得到注釋

4、的Unigene與體虱相關基因同源性最高，達59.93％。GO分析發(fā)現(xiàn)，共有19,355個Unigene被劃分到生物過程、細胞組分和分子功能3大主要類別的61個功能組中。在COG功能注釋中，嗜蟲書虱11,773個Unigene被歸類到25個COG功能家族中。
　　進一步對嗜蟲書虱轉(zhuǎn)錄組進行分析，篩選與藥劑解毒代謝相關的基因。根據(jù)Nr數(shù)據(jù)庫注釋，共鑒定得到68個P450 Unigene，平均長度為1,124bp，其中35個Unige

5、ne同CYP3集團親緣關系最近，18個Unigene屬于CYP4集團，有9個和6個Unigene分別與CYP2集團和線粒體集團基因同源性最高；同時，篩選鑒定出37個GSTs Unigene，平均長度為551bp，分屬于Delta、Omega、Sigma、Theta、Zeta以及Microsomal等GSTs家族，其中Delta家族和Sigma家族包含Unigene個數(shù)最多，分別為17個和13個。此外，篩選出19個CCEs基因，平均長度為

6、1,427bp，這些CCEs分為6個分支，Clade A、Clade D、Clade E、Clade F、Clade H和Clade J。
　　2.嗜蟲書虱5個P450基因的克隆與序列分析
　　基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫P450 Unigene片段信息，通過對cDNA全長序列的克隆和測序驗證，獲得5個嗜蟲書虱P450基因包含完整的開放閱讀框（ORF）的cDNA序列，分別命名為CYP358B1（KT071005）、CYP345P1（KT

7、071006）、CYP4FD2（KT071007、）、CYP4CD2（KT071008）和 CYP6JN1（KT071009）。上述5個P450基因ORF核苷酸長度介于1,500-1,554bp，所編碼的氨基酸序列長度范圍為499-517aa。通過使用Mega5.05軟件，應用Neighbor Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，明確這些基因與其他物種相應基因的親緣關系以及潛在的功能，發(fā)現(xiàn)這5個P450基因分布在CYP3和CYP4集團，說

8、明其有可能參與解毒代謝過程。
　　3.嗜蟲書虱P450基因的表達模式解析
　　3.1 嗜蟲書虱P450基因在不同性別及不同發(fā)育階段的表達模式
　　利用qPCR技術，對嗜蟲書虱5個P450具有全長cDNA序列的基因和12個基因片段（Unigene17618、Unigene25300、Unigene26646、Unigene6837、Unigene27020、Unigene13178、Unigene18998、Unigen

9、e25537、Unigene12385、Unigene6029、Unigene22015和Unigene25076）在不同性別中和不同發(fā)育階段的mRNA表達水平進行分析。結(jié)果表明，5個P450基因和10個Unigene（Unigene25300、Unigene26646、Unigene6837、Unigene27020、Unigene13178、Unigene18998、Unigene25537、Unigene12385、Unigene

10、6029和 Unigene22015）在雌成蟲的表達量均高于雄成蟲，相反，其余2個Unigene（Unigene17618和Unigene25076）在雌成蟲的表達量顯著低于雄成蟲。對嗜蟲書虱5個P450基因及12個Unigene在不同發(fā)育階段的表達模式進行分析，結(jié)果顯示，17個基因在整個發(fā)育階段均表達，且在成蟲期的表達水平高于若蟲期或卵期。其中，CYP345P1、CYP4CD2、CYP4CD2、CYP6JN1以及9個Unigene（U

11、nigene17618、Unigene26646、Unigene6837、Unigene27020、Unigene13178、Unigene25537、Unigene6029、Unigene22015和Unigene25076）在卵期及若蟲期表達量較低，隨著若蟲羽化為成蟲后，mRNA表達水平顯著增高，說明以上13個基因可能主要在成蟲期行使重要的作用。而CYP358B1和Unigene25300在卵期的相對表達量較高，推測其與卵期生理活動

12、及適應外界環(huán)境有關。
　　3.2 嗜蟲書虱P450基因?qū)λ巹┟{迫的響應模式
　　在生物測定基礎上，通過不同類型藥劑（擬除蟲菊酯類、有機磷類和氨基甲酸酯類）對嗜蟲書虱進行脅迫，分析P450基因的響應模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，嗜蟲書虱P450基因?qū)︸R拉硫磷脅迫的響應最為明顯，經(jīng)藥劑誘導后，5個P450基因和5個Unigene（Unigene26646、Unigene13178、Unigene18998、Unigene12385和Unige

13、ne25537）在12h達到表達高峰，其中CYP4CD2和CYP6JN1誘導表達上調(diào)幅度較大，分別為對照的9.77和9.47倍；24h后，多數(shù)基因的表達量又回落至對照組水平，這暗示P450基因?qū)τ袡C磷類殺蟲劑反應迅速且劇烈，但在體內(nèi)的代謝率可能比較緩慢。嗜蟲書虱多數(shù)P450基因可被溴氰菊酯誘導上調(diào)，其表現(xiàn)出的誘導效應相對滯后，表達高峰多出現(xiàn)在藥劑處理24h后，其中CYP345P1、CYP4CD2和CYP6JN1的相對表達量在誘導后不同時

14、間段呈現(xiàn)出拋物線的變化趨勢，而CYP4FD2在脅迫初期表達受到抑制，隨后逐漸升高，在處理36h后達到高峰。此外，Unigene25076和 Unigene22015的表達量在24h后出現(xiàn)一個峰值，而Unigene27020、Unigene25537、Unigene6029、Unigene18998和Unigene6837在藥劑誘導后表達量顯著降低。嗜蟲書虱P450基因經(jīng)殘殺威誘導后，CYP358B1和CYP6JN1的表達量在殘殺威（LC

15、50）誘導后出現(xiàn)一定程度上調(diào)，而CYP345P1、CYP4FD2和CYP4CD2基因經(jīng)殘殺威誘導后，其表達先受到一定程度的抑制，隨后隨著恢復時間延長，基因表達量逐漸上升；Unigene17618、Unigene25300、Unigene26646、Unigene13178、Unigene18998和Unigene12385的表達量在4個時間段內(nèi)的變化呈拋物線性，Unigene6837、Unigene25537、Unigene6029和U

16、nigene22015的表達量變化在誘導后的時間段內(nèi)呈 W型，Unigene25076的表達量在受到藥劑誘導后顯著下調(diào)，于24h上調(diào)至最大值，隨后回落直至低于對照組。
　　3.3 嗜蟲書虱P450基因在不同種群間的表達模式
　　以隨州種群的表達量為基準，其它種群相對表達量與之比較，發(fā)現(xiàn)5個基因在銅梁種群的表達豐度均顯著高于該基因在隨州種群的表達量，分別是在隨州種群中表達量的3.84、2.08、4.38、8.03和13.13倍

17、。其中CYP345P1和CYP4CD2在海南種群的表達量也相對較高，與隨州種群相比，分別約為5.00和6.37倍。
　　4.嗜蟲書虱抗性和敏感種群P450酶活性比較
　　對實驗室現(xiàn)有的嗜蟲書虱不同種群進行藥劑（溴氰菊酯、馬拉硫磷和殘殺威）敏感性測定發(fā)現(xiàn)，隨州種群對所測藥劑相對敏感，而銅梁種群抗性水平相對較高。據(jù)此，分析這2個種群P450酶活性的差異。結(jié)果表明，相對抗性種群的P450酶活性高于相對敏感種群，二者相差1.93倍。

18、經(jīng)藥劑脅迫后，P450s活性均呈現(xiàn)不同程度上升。其中，馬拉硫磷處理后P450s的活性是對照的2.97倍，且差異顯著；溴氰菊酯處理后P450s活性是對照的2.35倍。上述結(jié)果暗示細胞色素P450可能參與介導嗜蟲書虱抗性的形成，推測細胞色素P450能對不同類型的殺蟲劑產(chǎn)生代謝作用。
　　5.嗜蟲書虱P450基因真核表達載體構(gòu)建
　　選取嗜蟲書虱在藥劑處理后 mRNA相對表達量顯著變化的CYP4FD2為對象，采用雙酶切及DNA重組