魚類Sox30和Sox6的克隆、表達及其在性腺發(fā)育中作用的初步研究.pdf

1、Sox轉(zhuǎn)錄因子家族成員是一類與哺乳動物雄性性別決定基因Sry相關(guān)的高度保守的基因。該家族成員共有的特征是具有一個約79個氨基酸且可與DNA特異結(jié)合的高遷移率組盒區(qū)(HMG-box)。與哺乳動物Y染色體上Sry的HMG-box相比，Sox成員對應(yīng)的氨基酸組成至少有50％的同源性。迄今，在大多數(shù)脊椎動物已確定了大約20個Sox成員，該基因家族在進化過程中相當(dāng)保守，并且大部分Sox基因都廣泛參與了脊椎動物的發(fā)育過程，包括性別決定與分化。

2、>　　 Sox30和Sox6被認(rèn)為是參與脊椎動物性別分化的重要Sox成員。然而，到目前為止，Sox30僅在哺乳類和鳥類中克隆獲得，沒有關(guān)于在魚類存在該基因的相關(guān)報道，且有學(xué)者甚至認(rèn)為Sox30在低等脊椎動物可能是不存在的；Sox6已在人、小鼠和大鼠等少數(shù)物種中克隆，在硬骨魚類，只在虹鱒、斑馬魚中克隆得到1個Sox6/lz(Soxlz就是Sox6)和在東方鲀的基因組中分離得到2種不同的Sox6(Sox6a和Sox6b)。而且，Sox30

3、和Sox6在脊椎動物性別分化中的具體功能和作用機制現(xiàn)在尚不清楚。
　　 為進一步確定Sox30在低等脊椎動物尼羅羅非魚中是否存在，如果存在，該基因在其性別分化中具有怎樣的功能。另外，為闡明Sox6在羅非魚性別分化過程中的作用。本研究通過RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction)和RACE(rapid amplification of cDNA ends)相結(jié)合的

4、方法，從羅非魚克隆獲得了Sox30的4種cDNA、Sox30基因編碼區(qū)以及Sox6a和Sox6b的cDNA序列。應(yīng)用生物信息學(xué)方法對序列進行分析發(fā)現(xiàn)，Sox30編碼區(qū)包含5個外顯子和4個內(nèi)含子，并且由于選擇性剪切可能全少存在4種轉(zhuǎn)錄本，分別被命名為AS-Ⅰ到AS-Ⅳ；Sox6a和Sox6b編碼區(qū)均包含14個外顯子和13個內(nèi)含子。通過對基因組序列分析發(fā)現(xiàn)，和哺乳類、鳥類一樣，Sox30在兩棲動物爪蟾、脊索動物海鞘(Sox30也稱為SoxH

5、)和文昌魚中同樣存在，而在無脊椎動物不存在，表明Sox30可能是伴隨脊索動物的出現(xiàn)而出現(xiàn)的新基因；與東方鲀相同，在河鲀、青鳉中Sox6也存在2個平行同源基因(paralogous genes)。系統(tǒng)進化分析結(jié)果表明，羅非魚Sox30與其它已經(jīng)克隆或分離到的Sox30/H聚于同一進化枝；與東方鲀、河鲀相同，羅非魚Sox6a和Sox6b聚于兩個不同進化枝。這些結(jié)果表明Sox30/H普遍存在于整個脊索/脊椎動物；Sox6a和Sox6b廣泛存在

6、于硬骨魚類，進一步支持硬骨魚類經(jīng)歷了一次特有基因組復(fù)制的理論。將羅非魚Sox30、Sox6a和Sox6b與所有已被克隆或分離的脊索或脊椎動物相應(yīng)基因序列分別進行同源性比較，結(jié)果顯示Sox30在除HMG-box外的區(qū)域保守性非常低，即便存HMG-box物種間的相似性也只有50％左右；Sox6a和Sox6b的保守性則非常高，分別達到88％和78％，在HMG-box區(qū)域更高，相似性都超過90％。同時序列對比還發(fā)現(xiàn)羅非魚Sox30、Sox6a和

7、Sox6b都比其它物種的相應(yīng)基因編碼的氨基酸序列短了一段。此外，為了弄清楚Sox基因的進化歷史和各成員間的相互關(guān)系，本研究還對Sox基因家族進行了系統(tǒng)發(fā)生分析，分析結(jié)果支持Sox基因被劃分為10個不同亞族即從A到J亞族和該基因家族成員的增加是通過單個祖先基因擴展成多個相關(guān)基因的論斷。同時，本研究還根據(jù)Sox基因成員在系統(tǒng)發(fā)生分析中的確切位置對脊椎動物中某些命名不正確的成員進行了更正。
　　 通過RT-PCR分析成體(8月齡)羅非

8、魚各組織的分布發(fā)現(xiàn)，Sox30的4種亞型只在性腺特異表達，在其他組織未檢測到表達，而Sox6a和Sox6b則不僅在性腺表達，也在其它多種組織廣泛表達，并且三者在性腺的表達都呈現(xiàn)明顯的性別二態(tài)型：就Sox30而言，AS-Ⅰ在精巢中的表達量明顯高于卵巢，與AS-Ⅰ相反，AS-Ⅳ在卵巢的表達水平卻高于精巢，而AS-Ⅱ是精巢特異性表達的亞型；對Sox6來說，Sox6a在精巢中表達量較高，而Sox6b則在卵巢中表達水平較高。
　　 個體發(fā)

9、生結(jié)果表明，Sox30、Sox6a和Sox6b都在性腺發(fā)育的較早時期就開始表達：Sox30開始表達于孵化后10天(days after hatching，dah)，早于羅非魚性腺的組織學(xué)形態(tài)分化期(大約為25dah)，其中AS-Ⅱ從90dah開始直到成體均出現(xiàn)雄性性腺特異性表達，驗證了組織分布中該亞型僅在雄性性腺表達的結(jié)果；有意思的是AS-Ⅲ只在10dah的雄性性腺特異表達，在其他時期均未檢測到表達；而AS-Ⅰ和AS-Ⅳ不僅表達于雄性性

10、腺，也在雌性性腺中表達，而且AS-Ⅰ在10、15dah時表現(xiàn)為雌性性腺特異表達。Sox6a和Sox6b則在5dah時(此時為羅非魚性別決定的關(guān)鍵期)的性腺就已開始表達，且在5dah時Sox6b只在雄性性腺表達。
　　 在性逆轉(zhuǎn)成體性腺中，Sox30的3種選擇性剪切亞型都表現(xiàn)出明顯的與表型性別相關(guān)的表達模式，AS-Ⅱ僅在正常XY(())和性逆轉(zhuǎn)XX(())中表達，與組織分布、個體發(fā)生中該亞型為雄性特異表達的結(jié)果相一致；AS-Ⅰ在性

11、逆轉(zhuǎn)XY(♀)比較正常XY(())性腺表達下調(diào)，而在性逆轉(zhuǎn)的XX(())相對正常XX(♀)性腺則表達上調(diào)，該結(jié)果與先前得到的AS-Ⅰ在精巢中的表達量較高一致；在性逆轉(zhuǎn)XY(♀)AS-Ⅳ表達上調(diào)，也與先前得到的AS-Ⅳ在卵巢中的表達量較高結(jié)論一致，不過在性逆轉(zhuǎn)的XX(())性腺AS-Ⅳ卻沒有出現(xiàn)明顯的表達變化。
　　 通過原位雜交進一步研究發(fā)現(xiàn)，Sox30(由于無法設(shè)計合成區(qū)別每種亞型的探針，因此本研究選用的是能夠雜交4種Sox3

12、0亞型mRNAs的探針)在10dah時雄性性腺的生殖細胞和雌性性腺的體細胞表達，而先前的個體發(fā)生揭示，在10dah時雄性性腺只存在AS-Ⅲ的表達，而雌性性腺僅表達AS-Ⅰ，因此認(rèn)為此時在雄性性腺生殖細胞表達的信號來自于AS-Ⅲ，在雌性性腺體細胞表達的信號則源自AS-Ⅰ；Sox30在4個月時精巢中精子和卵巢中間質(zhì)細胞及7個月時精巢中精子和卵巢的鞘膜、顆粒細胞表達，而在相應(yīng)時期的精巢同時存在AS-Ⅰ、AS-Ⅱ和AS-Ⅳ的表達，在卵巢也存在A