Sox-3在食管鱗癌淋巴轉(zhuǎn)移中的作用及機制研究.pdf

1、背景與目的：在全世界最常見的惡性腫瘤中，食管癌的發(fā)病率位居第8，死亡率位居第6位。在過去的40年中，隨著診斷、手術(shù)和放化療水平的不斷提高，食管癌的5年生存率緩慢升高，但是依然低于19％。食管癌有兩種主要的病理類型：食管腺癌和食管鱗癌。中國是世界上食管癌的高發(fā)地區(qū)之一，其中食管鱗癌占95%，是國內(nèi)發(fā)病率第3、死亡率第4位的惡性腫瘤。和腺癌相比較，食管鱗癌的預(yù)后更差，其根治性手術(shù)后的10年生存率長期徘徊在20%左右。目前已經(jīng)證實，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

2、是食管鱗癌最重要的預(yù)后因素之一，食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的狀態(tài)決定腫瘤的分期、治療方式的選擇和預(yù)后。但是目前食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的機制尚不清楚，臨床上也缺乏有效的預(yù)測和治療食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的方法。
　　Sox-3是一種轉(zhuǎn)錄因子，歸屬于Sox蛋白家族B1亞組。在脊椎動物胚胎發(fā)育早期調(diào)控神經(jīng)細胞的發(fā)育和分化，并在發(fā)育過程中表達逐步降。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，Sox-3是一種原癌基因，可能和腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。我們在前期的研究中，發(fā)現(xiàn)食管鱗癌組織So

3、x-3的表達與區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)，表現(xiàn)為Sox-3高表達患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率明顯升高，并且預(yù)后不良。提示 Sox-3的表達可能促進了食管鱗癌的淋巴轉(zhuǎn)移，并影響患者的預(yù)后。已有的證據(jù)表明，食管鱗癌患者腫瘤相關(guān)淋巴管的密度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)。而VEGF-C/D-VEGFR3是調(diào)控淋巴管生成、淋巴管擴張和通透性主要的信號通路。VEGF-C或VEGF-D的高表達與腫瘤侵犯的深度、腫瘤分期、腫瘤淋巴管的密度、淋巴管受侵和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)

4、。
　　綜上，推測Sox-3的表達可能促進食管鱗癌淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，并且和淋巴管生成以及VEGF-C/D-VEGFR3信號系統(tǒng)相關(guān)。為了闡明Sox-3在食管鱗癌淋巴轉(zhuǎn)移中的作用及可能的機制，利用本實驗室已經(jīng)構(gòu)建的不同Sox-3表達水平的人食管鱗癌細胞模型，通過體外和體內(nèi)實驗，選擇Western blot、RT-PCR、ELISA、免疫組化研究等方法研究，探討Sox-3在食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的作用及其可能的機制，為探索食管

5、鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷和靶向治療提供新的方向。
　　方法：
　　1.利用本實驗室構(gòu)建的不同Sox-3表達水平的食管鱗癌細胞模型，通過Western blot和qRT-PCR驗證其Sox-3的差異表達后，通過細胞培養(yǎng)、MTT增殖實驗、流式細胞術(shù)、劃痕實驗、Transwell侵襲實驗和條件培養(yǎng)基淋巴管內(nèi)皮細胞成管實驗考察在體外Sox-3的表達，對于人食管鱗癌TE-10細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移，特別是誘導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮細胞成管能力的影

6、響。研究Sox-3對于食管鱗癌發(fā)生發(fā)展和淋巴轉(zhuǎn)移可能的調(diào)控作用。
　　2.通過裸鼠右側(cè)腋下注射不同Sox-3表達水平的TE-10細胞，構(gòu)建裸鼠移植瘤模型。對移植瘤的發(fā)生、發(fā)展過程、成瘤的大小和同側(cè)腋窩淋巴結(jié)的大小進行比較，組織切片HE染色，檢查比較淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況；通過Western blot和免疫組化，檢測不同Sox-3表達水平的TE-10細胞移植瘤樣本中VEGF-C/D的表達，來進一步研究Sox-3對于食管鱗癌淋巴轉(zhuǎn)移的影響。<

7、br>　　3.在體外細胞培養(yǎng)，通過Western blot和ELISA實驗檢測抑制Sox-3的表達，對于TE-10細胞VEGF-C/D表達和分泌的影響。在淋巴管內(nèi)皮細胞成管實驗中，加入VEGFR-3的抗體 SAR131675阻斷淋巴管內(nèi)皮細胞 VEGFR-3的功能，來研究 VEGF-C/D通路在Sox-3促進食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中可能的作用機制。
　　結(jié)果：
　　1.通過Western blot實驗和qRT-PCR實驗證實

8、，TE-10細胞經(jīng)Sox-3 siRNA慢病毒感染后構(gòu)建的不同Sox-3表達的人食管鱗癌細胞模型是成功的，對照組TE-10細胞和空載組TE-10細胞Sox-3的表達類似，均顯著高于干擾組TE-10細胞。MTT、流式細胞術(shù)、劃痕實驗、transwell實驗和條件培養(yǎng)基淋巴管內(nèi)皮細胞成管實驗證實：Sox-3可顯著促進人食管鱗癌細胞的增殖、侵襲、遷移和淋巴管內(nèi)皮細胞成管的能力，而對細胞凋亡有抑制作用。
　　2.成功構(gòu)建裸鼠移植瘤模型，測

9、量結(jié)果顯示：和Sox-3低表達的干擾組相比，Sox-3高表達的空載組小鼠移植瘤的生長速度和成瘤大小類似，但是移植瘤同側(cè)腋窩淋巴結(jié)的體積顯著增大。病理學(xué)檢查顯示Sox-3高表達組小鼠淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移率顯著增高。Western blot和免疫組化檢測顯示，空載組移植瘤組織VEGF-C和VEGF-D的表達均顯著強于干擾組。表明表明Sox-3對食管鱗癌TE-10細胞體內(nèi)成瘤和生長的影響不大，但是可能促進食管鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，并且和VEGF-C和VE

10、GF-D的表達相關(guān)。
　　3. Western blot和ELISA實驗結(jié)果顯示，抑制 TE-10細胞 Sox-3的表達，可使其VEGF-C和 VEGF-D的表達和分泌顯著下降；在淋巴管內(nèi)皮細胞成管實驗中，使用SAR131675阻斷淋巴管內(nèi)皮細胞VEGFR-3的功能后，各組TE-10細胞成管的數(shù)目均顯著下降，并且組間無差異。表明 Sox-3在食管鱗癌 TE-10細胞可顯著上調(diào) VEGF-C和VEGF-D的表達和分泌，Sox-3促進

11、淋巴管的生成，是通過VEGF-C/VEGF-D/VEGFR-3通路實現(xiàn)的。
　　結(jié)論：
　　1.在體外Sox-3可顯著促進人食管鱗癌細胞的增殖、侵襲和遷移，抑制細胞凋亡，但是在體內(nèi)Sox-3對于食管鱗癌細胞成瘤的速度和大小影響不大。
　　2.在體外Sox-3可顯著增強人食管鱗癌細胞誘導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮細胞成管的能力，在體內(nèi)Sox-3可促進食管鱗癌細胞成瘤后的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。
　　3.Sox-3在食管鱗癌細胞的表達，上調(diào)腫瘤