Sox-3在食管鱗癌淋巴轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的：在全世界最常見的惡性腫瘤中，食管癌的發(fā)病率位居第8，死亡率位居第6位。在過去的40年中，隨著診斷、手術(shù)和放化療水平的不斷提高，食管癌的5年生存率緩慢升高，但是依然低于19％。食管癌有兩種主要的病理類型：食管腺癌和食管鱗癌。中國是世界上食管癌的高發(fā)地區(qū)之一，其中食管鱗癌占95%，是國內(nèi)發(fā)病率第3、死亡率第4位的惡性腫瘤。和腺癌相比較，食管鱗癌的預(yù)后更差，其根治性手術(shù)后的10年生存率長期徘徊在20%左右。目前已經(jīng)證實(shí)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

2、是食管鱗癌最重要的預(yù)后因素之一，食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的狀態(tài)決定腫瘤的分期、治療方式的選擇和預(yù)后。但是目前食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不清楚，臨床上也缺乏有效的預(yù)測(cè)和治療食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的方法。
　　Sox-3是一種轉(zhuǎn)錄因子，歸屬于Sox蛋白家族B1亞組。在脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育早期調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育和分化，并在發(fā)育過程中表達(dá)逐步降。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，Sox-3是一種原癌基因，可能和腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。我們?cè)谇捌诘难芯恐?，發(fā)現(xiàn)食管鱗癌組織So

3、x-3的表達(dá)與區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)，表現(xiàn)為Sox-3高表達(dá)患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率明顯升高，并且預(yù)后不良。提示 Sox-3的表達(dá)可能促進(jìn)了食管鱗癌的淋巴轉(zhuǎn)移，并影響患者的預(yù)后。已有的證據(jù)表明，食管鱗癌患者腫瘤相關(guān)淋巴管的密度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)。而VEGF-C/D-VEGFR3是調(diào)控淋巴管生成、淋巴管擴(kuò)張和通透性主要的信號(hào)通路。VEGF-C或VEGF-D的高表達(dá)與腫瘤侵犯的深度、腫瘤分期、腫瘤淋巴管的密度、淋巴管受侵和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)

4、。
　　綜上，推測(cè)Sox-3的表達(dá)可能促進(jìn)食管鱗癌淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，并且和淋巴管生成以及VEGF-C/D-VEGFR3信號(hào)系統(tǒng)相關(guān)。為了闡明Sox-3在食管鱗癌淋巴轉(zhuǎn)移中的作用及可能的機(jī)制，利用本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建的不同Sox-3表達(dá)水平的人食管鱗癌細(xì)胞模型，通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，選擇Western blot、RT-PCR、ELISA、免疫組化研究等方法研究，探討Sox-3在食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的作用及其可能的機(jī)制，為探索食管

5、鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷和靶向治療提供新的方向。
　　方法：
　　1.利用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的不同Sox-3表達(dá)水平的食管鱗癌細(xì)胞模型，通過Western blot和qRT-PCR驗(yàn)證其Sox-3的差異表達(dá)后，通過細(xì)胞培養(yǎng)、MTT增殖實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)和條件培養(yǎng)基淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)考察在體外Sox-3的表達(dá)，對(duì)于人食管鱗癌TE-10細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移，特別是誘導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞成管能力的影

6、響。研究Sox-3對(duì)于食管鱗癌發(fā)生發(fā)展和淋巴轉(zhuǎn)移可能的調(diào)控作用。
　　2.通過裸鼠右側(cè)腋下注射不同Sox-3表達(dá)水平的TE-10細(xì)胞，構(gòu)建裸鼠移植瘤模型。對(duì)移植瘤的發(fā)生、發(fā)展過程、成瘤的大小和同側(cè)腋窩淋巴結(jié)的大小進(jìn)行比較，組織切片HE染色，檢查比較淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況；通過Western blot和免疫組化，檢測(cè)不同Sox-3表達(dá)水平的TE-10細(xì)胞移植瘤樣本中VEGF-C/D的表達(dá)，來進(jìn)一步研究Sox-3對(duì)于食管鱗癌淋巴轉(zhuǎn)移的影響。<

7、br>　　3.在體外細(xì)胞培養(yǎng)，通過Western blot和ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抑制Sox-3的表達(dá)，對(duì)于TE-10細(xì)胞VEGF-C/D表達(dá)和分泌的影響。在淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)中，加入VEGFR-3的抗體 SAR131675阻斷淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞 VEGFR-3的功能，來研究 VEGF-C/D通路在Sox-3促進(jìn)食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中可能的作用機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1.通過Western blot實(shí)驗(yàn)和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)

8、，TE-10細(xì)胞經(jīng)Sox-3 siRNA慢病毒感染后構(gòu)建的不同Sox-3表達(dá)的人食管鱗癌細(xì)胞模型是成功的，對(duì)照組TE-10細(xì)胞和空載組TE-10細(xì)胞Sox-3的表達(dá)類似，均顯著高于干擾組TE-10細(xì)胞。MTT、流式細(xì)胞術(shù)、劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell實(shí)驗(yàn)和條件培養(yǎng)基淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)證實(shí)：Sox-3可顯著促進(jìn)人食管鱗癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞成管的能力，而對(duì)細(xì)胞凋亡有抑制作用。
　　2.成功構(gòu)建裸鼠移植瘤模型，測(cè)

9、量結(jié)果顯示：和Sox-3低表達(dá)的干擾組相比，Sox-3高表達(dá)的空載組小鼠移植瘤的生長速度和成瘤大小類似，但是移植瘤同側(cè)腋窩淋巴結(jié)的體積顯著增大。病理學(xué)檢查顯示Sox-3高表達(dá)組小鼠淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移率顯著增高。Western blot和免疫組化檢測(cè)顯示，空載組移植瘤組織VEGF-C和VEGF-D的表達(dá)均顯著強(qiáng)于干擾組。表明表明Sox-3對(duì)食管鱗癌TE-10細(xì)胞體內(nèi)成瘤和生長的影響不大，但是可能促進(jìn)食管鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，并且和VEGF-C和VE

10、GF-D的表達(dá)相關(guān)。
　　3. Western blot和ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，抑制 TE-10細(xì)胞 Sox-3的表達(dá)，可使其VEGF-C和 VEGF-D的表達(dá)和分泌顯著下降；在淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)中，使用SAR131675阻斷淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞VEGFR-3的功能后，各組TE-10細(xì)胞成管的數(shù)目均顯著下降，并且組間無差異。表明 Sox-3在食管鱗癌 TE-10細(xì)胞可顯著上調(diào) VEGF-C和VEGF-D的表達(dá)和分泌，Sox-3促進(jìn)

11、淋巴管的生成，是通過VEGF-C/VEGF-D/VEGFR-3通路實(shí)現(xiàn)的。
　　結(jié)論：
　　1.在體外Sox-3可顯著促進(jìn)人食管鱗癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，抑制細(xì)胞凋亡，但是在體內(nèi)Sox-3對(duì)于食管鱗癌細(xì)胞成瘤的速度和大小影響不大。
　　2.在體外Sox-3可顯著增強(qiáng)人食管鱗癌細(xì)胞誘導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞成管的能力，在體內(nèi)Sox-3可促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞成瘤后的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。
　　3.Sox-3在食管鱗癌細(xì)胞的表達(dá)，上調(diào)腫瘤