食管鱗癌組織與轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的鱗癌細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、食管癌作為威脅中國人民健康的重大疾病，是常見的惡性腫瘤中的第四位，食管鱗形細(xì)胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是最主要的死亡原因之一，生存率很低的一個(gè)主要原因是腫瘤患者在初次診斷為食管癌時(shí)就已經(jīng)發(fā)生了腫瘤的轉(zhuǎn)移，其預(yù)后極差主要與患者發(fā)生的廣泛轉(zhuǎn)移有關(guān)。故此，腫瘤轉(zhuǎn)移已成為影響患者5年存活期的重要因素，其中食管床的局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(Regional lymph nodemetastasis

2、)在臨床上非常重要，理應(yīng)受到密切關(guān)注。在大量有關(guān)食管鱗癌的研究中，尚未有食管鱗癌組織與轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的鱗癌細(xì)胞的蛋白組學(xué)研究的報(bào)道，究其原因，可能與在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中除了轉(zhuǎn)移的食管鱗癌細(xì)胞外，還存在大量的淋巴細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞等，如何排除非癌細(xì)胞的干擾，以保證樣本的均質(zhì)性存在相當(dāng)?shù)睦щy。 為了探討鱗癌細(xì)胞在食管鱗癌組織與轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的蛋白質(zhì)表達(dá)差異，本研究首次應(yīng)用激光捕獲顯微切割(Laser capturemicrodissection，

3、LCM)技術(shù)分離出正常食管上皮細(xì)胞、食管鱗癌組織和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的食管鱗癌細(xì)胞，使用差異蛋白質(zhì)組技術(shù)包括雙向凝膠電泳(Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，2-DE)、基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix-assisted laserdesorption/ionization mass spectrometry-time of night，MALDI-TOF)技術(shù)

4、對(duì)這些細(xì)胞的蛋白進(jìn)行分析，獲得了一些可能與食管鱗癌惡變、轉(zhuǎn)移過程有關(guān)的標(biāo)志蛋白質(zhì)，推測其差異蛋白質(zhì)的功能，并從蛋白質(zhì)的整體水平上探討這些差異候選蛋白質(zhì)是否與食管鱗癌可能的發(fā)生或轉(zhuǎn)移機(jī)制相關(guān)，并為開展臨床早期診斷、尋找治療靶點(diǎn)等方面提供有價(jià)值的理論依據(jù)。 第一部分激光捕獲顯微切割技術(shù)在食管鱗癌蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用 目的：探討激光捕獲顯微切割技術(shù)在獲得較單一食管鱗癌細(xì)胞中的價(jià)值，為食管鱗癌蛋白質(zhì)組學(xué)的研究奠定基礎(chǔ)。

5、 方法：通過激光捕獲顯微切割技術(shù)分別獲取食管鱗癌細(xì)胞和正常食管上皮細(xì)胞、食管鱗癌組織和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的鱗癌細(xì)胞。 結(jié)果：激光捕獲了較純的正常食管上皮細(xì)胞和食管鱗癌細(xì)胞、食管鱗癌組織和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的鱗癌細(xì)胞，分別獲得到了分辨率和重復(fù)性較好的雙向凝膠電泳圖譜。 結(jié)論：本研究結(jié)果提示激光捕獲顯微切割可以有效地解決組織異質(zhì)性的問題，能較好地獲取較為均一的目的細(xì)胞。 第二部分正常食管上皮細(xì)胞和食管鱗癌組織中的鱗癌細(xì)胞的差異蛋

6、白組學(xué)分析 目的：分析食管鱗癌和正常食管上皮細(xì)胞蛋白質(zhì)的表達(dá)差異，獲取兩者的蛋白表達(dá)差異。 方法：通過激光捕獲顯微切割技術(shù)分離食管鱗癌和正常食管上皮細(xì)胞的純細(xì)胞，通過雙向電泳和質(zhì)譜的方法檢測兩者表達(dá)的差異蛋白。 結(jié)果：分別發(fā)現(xiàn)了38-55個(gè)差異蛋白點(diǎn)，通過質(zhì)譜鑒定出20種有意義的蛋白，其中11種蛋白如galectin 7、14-3-3 protein ε等在食管鱗癌細(xì)胞表達(dá)明顯增高，9種蛋白如MTCBP-1等表達(dá)

7、下調(diào)。 結(jié)論：食管鱗癌和正常食管上皮細(xì)胞的2-DE蛋白質(zhì)圖譜具有明顯的差異表達(dá)，提示食管鱗癌的發(fā)生是多種蛋白質(zhì)功能共同作用的結(jié)果。 第三部分食管鱗癌組織和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的鱗癌細(xì)胞的差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析 目的：分析食管鱗癌組織和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的鱗癌細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)差異。 方法：通過激光捕獲顯微切割技術(shù)分離食管鱗癌組織和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的鱗癌細(xì)胞，通過雙向電泳和質(zhì)譜的方法檢測兩者表達(dá)的差異蛋白。 結(jié)果：分別發(fā)現(xiàn)

8、了20-29個(gè)差異蛋白點(diǎn)，通過質(zhì)譜鑒定出6種有意義的蛋白，轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的鱗癌細(xì)胞中如等5種蛋白如peroxiredoxin 1，gelsolin family-capping proteins等表達(dá)明顯增高，1種蛋白MTCBP-1表達(dá)下調(diào)。 結(jié)論：食管鱗癌組織中的鱗癌細(xì)胞與轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的鱗癌細(xì)胞的2-DE蛋白質(zhì)圖譜具有明顯的差異表達(dá)，提示這些蛋白質(zhì)可能與食管鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。 第四部分差異候選蛋白的驗(yàn)證 目的

9、：為了保證鑒定結(jié)果的可靠性，以及便于將來這些蛋白作為臨床早期診斷的標(biāo)志或作為治療的藥物時(shí)更易檢測，驗(yàn)證差異蛋白確實(shí)在正常食管上皮組織、食管鱗癌組織和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)間存在顯著差異。 方法：使用westren blotting和免疫組化技術(shù)對(duì)差異候選蛋白進(jìn)行差異分析、驗(yàn)證。 結(jié)果：MnSOD、14-3.3 protein ε在食管鱗癌組織中的鱗癌細(xì)胞的表達(dá)高于正常食管上皮細(xì)胞的表達(dá)，Gelsolin family-capping