葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78在食管鱗癌轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制的研究.pdf

1、【背景】
　　食管癌是世界最常見的惡性腫瘤之一,據(jù)2011年CAcancer報(bào)道,食管鱗癌發(fā)病率位居第8位,死亡率位居第6位[1]。手術(shù)及其放化療是食管鱗癌治療的主要方式,然而仍然有70％的晚期患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。食管癌晚期侵襲轉(zhuǎn)移,嚴(yán)重影響了食管癌患者療效和預(yù)后。侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要特征之一,也是腫瘤患者最主要的致死原因[2]。食管癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程,其具體分子生物學(xué)機(jī)制包括了cyclinD1和

2、c-Myc的表達(dá)水平升高,p53和p16的突變等[3],此外,研究還報(bào)道了基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrixmetalloproteinases,MMPs)和上皮一間葉轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymaltransition,EMT)相關(guān)分子都參與了食管癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程,然而其具體機(jī)制尚未完全闡明。近年來,大量研究表明葡萄糖調(diào)節(jié)蛋78(Glucoseregulatedprotein,GRP78)參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程,包括

3、肝癌、結(jié)腸癌、肺癌和胃癌等[4]。此外,已有文獻(xiàn)報(bào)道,GRP78參與了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程[5],然而關(guān)于GRP78在食管癌侵襲轉(zhuǎn)移方向并未見報(bào)道。
　　【目的】
　　1.探討GRP78在食管鱗癌組織中的表達(dá)相關(guān)性;
　　2.建立食管癌高低轉(zhuǎn)移細(xì)胞亞系,并對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證;
　　3.GRP78在食管癌高低轉(zhuǎn)移細(xì)胞亞系中的表達(dá)變化;
　　4.在食管癌細(xì)胞中,小干擾RNA下調(diào)GRP78后探討GRP78在食管鱗癌侵襲

4、轉(zhuǎn)移中的作用;
　　5.在食管癌細(xì)胞中,小干擾RNA下調(diào)GRP78后探討GRP78促進(jìn)食管鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移的可能分子機(jī)制。
　　【方法】
　　1.收集113例食管癌患者組織,免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)食管鱗癌組織中GRP78的表達(dá),并分析其與臨床病理資料的相關(guān)性;收集患者預(yù)后資料,并分析GRP78表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系;
　　2.收集10例食管癌患者新鮮組織,Westernblot和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GRP78在食管

5、鱗癌患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織和未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中的表達(dá)水平;
　　3.選用食管癌細(xì)胞系EC109,EC9706,利用反復(fù)的transwell方法建立食管癌高低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系,并對(duì)其轉(zhuǎn)移能力進(jìn)行驗(yàn)證;
　　4.Westernblot實(shí)驗(yàn)和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GRP78在食管癌高低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系中的表達(dá)水平變化;
　　5.利用小干擾RNA技術(shù)下調(diào)食管癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞中GRP78的表達(dá)并對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證,驗(yàn)證成功后,體內(nèi)裸鼠轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)及體

6、外transwell、劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GRP78在食管鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用;
　　6.Westernblot檢測(cè)下調(diào)GRP78的表達(dá)后轉(zhuǎn)移相關(guān)分子MMPs和EMT相關(guān)分子的表達(dá)情況,初步分析GRP78在食管鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制。
　　【結(jié)果】
　　1.通過分析GRP78表達(dá)與食管癌患者臨床特征分析結(jié)果表明,GRP78的表達(dá)水平與食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及淋巴管浸潤(rùn)密切相關(guān),GRP78表達(dá)越強(qiáng),食管癌患者的5年生存率越差;

7、>　　2.利用transwell實(shí)驗(yàn)成功建立了食管癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系EC109-P,EC9706-P和食管癌低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系和EC109-N,EC9706-N;并用體外transwell實(shí)驗(yàn),劃痕實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行了鑒定,體內(nèi)裸鼠內(nèi)臟轉(zhuǎn)移也驗(yàn)證了兩對(duì)細(xì)胞亞系的侵襲轉(zhuǎn)移能力的不同;3.Westernblot實(shí)驗(yàn)和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在兩對(duì)高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系中GRP78表達(dá)水平較相應(yīng)的低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系表達(dá)升高;
　　4.小干擾RNA下調(diào)GRP78表達(dá)后

8、,Westernblot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其下調(diào)效果,transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)證實(shí)兩對(duì)高轉(zhuǎn)移食管鱗癌細(xì)胞在下調(diào)GRP78表達(dá)后,其侵襲和轉(zhuǎn)移能力明顯下降;
　　5.小干擾RNA下調(diào)GRP78表達(dá)后,體內(nèi)裸鼠轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)證實(shí)食管鱗癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力下降;
　　6.小干擾RNA下調(diào)兩對(duì)食管癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞亞系中的GRP78表達(dá)后,MMP2,MMP9表達(dá)較對(duì)照組相應(yīng)降低。
　　【結(jié)論】
　　1.在食管鱗癌中GRP78表達(dá)水平