綿羊POU5F1、SOX2、KLF4和MYC基因的克隆、序列特征及其在睪丸中的表達分析研究.pdf

1、【目的】
　?、膨炞CPOU5F1(POU domain, class5, transcription factor1)、SOX2[SRY(sex determining region Y)-box2]、KLF4[Kruppel-like factor4(gut)]和 MYC(myelocytomatosis oncogene)基因在綿羊睪丸組織中的表達方式并克隆表達的mRNA序列。構(gòu)建攜帶綿羊重編程因子基因序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因傳遞

2、表達載體，為將來獲得綿羊 Leydig細胞源誘導多功能干細胞（inducedpluripotent stem cell,iPSC）系提供物質(zhì)基礎(chǔ)。
　?、朴肏SD3B染色方法確定成年小鼠Leydig細胞的體外生長形態(tài)特征，為更好地鑒別體外培養(yǎng)的綿羊Leydig細胞提供技術(shù)基礎(chǔ)。
　　【方法】
　　⑴互補DNA模板來源于1周齡和6月齡大的湖羊的睪丸組織，通過RT-PCR和測序分別驗證了POU5F1、SOX2、KLF4和M

3、YC基因在綿羊睪丸中的表達方式以及分別對表達的mRNA進行分子克隆。
　?、苹蚪M模板來自培養(yǎng)的30-40妊娠日齡的蒙古綿羊的胎兒成纖維細胞，通過PCR和測序驗證綿羊KLF4的基因組序列。
　?、菢?gòu)建4個攜帶綿羊重編程因子基因序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因傳遞表達載體，分別為pMXs-oPOU5F1、pMXs-oSOX2、pMXs-oKLF4和pMXs-oMYC質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶酶切法和測序法驗證構(gòu)建質(zhì)粒序列的正確性。
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4、將參照組的pMXs-GFP質(zhì)粒和構(gòu)建的4個質(zhì)粒運用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法分別轉(zhuǎn)染入Phoenix Amphotropic細胞系。轉(zhuǎn)染48 h和72 h后，在熒光條件下觀察pMXs-GFP的轉(zhuǎn)染效果，并對培養(yǎng)的新生綿羊的Leydig細胞進行感染。細胞感染4 d后，在熒光條件下觀察pMXs-GFP質(zhì)粒對綿羊Leydig細胞的感染效果，并用RT-PCR法驗證這4個質(zhì)粒攜帶基因的外源表達情況。⑹2月齡大的小鼠睪丸，剝離白膜后，用膠原酶消化獲得Leydig

5、細胞。Leydig細胞通過HSD3B染色方法鑒定。
　　【結(jié)果】
　?、臥OU5F1在新生的和性成熟的湖羊睪丸中均表達。綿羊POU5F1的mRNA包含了一個1080 bp的開放閱讀框（open reading frame，ORF），編碼了359個氨基酸。綿羊POU5F1含有1個POU結(jié)構(gòu)域和1個homeobox結(jié)構(gòu)域。綿羊POU5F1蛋白第206位的賴氨酸和第207位的纈氨酸的序列是物種特異的，其它的哺乳動物在此對應的賴氨酸

6、和纈氨酸位點之間還有一個色氨酸。
　?、芐OX2在新生的和性成熟的湖羊睪丸中均表達。綿羊SOX2的mRNA含有一個963 bp的ORF，編碼了320個氨基酸。綿羊SOX2含有1個HMG(high mobility group)結(jié)構(gòu)域。
　?、荕YC在新生的綿羊睪丸中表達。綿羊MYC的mRNA包含了一個1320 bp的ORF，編碼了439個氨基酸。綿羊MYC含有1個 HLH（helix-loop-helix）結(jié)構(gòu)域。
　

7、?、染d羊KLF4基因組從起始密碼子到終止密碼子的序列長度為3159 bp，含有一個1434 bp的ORF，編碼了477個氨基酸的蛋白質(zhì)。綿羊KLF4基因含有4個外顯子和3個內(nèi)含子。綿羊KLF4蛋白在肽鏈的碳端有3個C2H2(cysteine2/histidine2)型的鋅指。POU5F1、SOX2、KLF4和MYC氨基酸序列分析表明綿羊與牛有著最近的進化關(guān)系，與靈長類和嚙齒類有著相對較遠的進化關(guān)系。SOX2和KLF4蛋白的氨基酸序列在綿

8、羊和牛中是100％的一致。
　?、上拗菩詢?nèi)切酶酶切法和測序法驗證了構(gòu)建的pMXs-oPOU5F1、pMXs-oSOX2、pMXs-oKLF4和pMXs-oMYC質(zhì)粒序列的正確性。通過用pMXs-GFP質(zhì)粒做對照，預測這4個構(gòu)建的質(zhì)粒能夠在AMPHO細胞系中有效地轉(zhuǎn)染。RT-PCR結(jié)果表明，這4個逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒攜帶的外源基因均能夠在綿羊Leydig細胞基因組中整合并轉(zhuǎn)錄。
　　⑹HSD3B染色鑒定后表明，培養(yǎng)48 h的成年小鼠

9、Leydig細胞，在光學顯微鏡下能夠清晰地分辨出Leydig細胞的細胞核與細胞質(zhì)。Leydig細胞的細胞核大而圓；細胞質(zhì)布滿了致密的脂滴，細胞質(zhì)折光性強。Leydig細胞培養(yǎng)5 d后，細胞充分伸展，形態(tài)多樣。一些細胞聚集生長，一些細胞單獨生長。聚集生長的各個細胞通過細胞的觸角
　　【目的】
　?、膨炞CPOU5F1(POU domain, class5, transcription factor1)、SOX2[SRY(sex

10、determining region Y)-box2]、KLF4[Kruppel-like factor4(gut)]和 MYC(myelocytomatosis oncogene)基因在綿羊睪丸組織中的表達方式并克隆表達的 mRNA序列。構(gòu)建攜帶綿羊重編程因子基因序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因傳遞表達載體，為將來獲得綿羊 Leydig細胞源誘導多功能干細胞（ induced pluripotent stem cell,iPSC）系提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

11、
　?、朴肏SD3B染色方法確定成年小鼠Leydig細胞的體外生長形態(tài)特征，為更好地鑒別體外培養(yǎng)的綿羊Leydig細胞提供技術(shù)基礎(chǔ)。
　　【方法】
　　⑴互補DNA模板來源于1周齡和6月齡大的湖羊的睪丸組織，通過RT-PCR和測序分別驗證了POU5F1、SOX2、KLF4和MYC基因在綿羊睪丸中的表達方式以及分別對表達的mRNA進行分子克隆。
　?、苹蚪M模板來自培養(yǎng)的30-40妊娠日齡的蒙古綿羊的胎兒成纖維細胞

12、，通過PCR和測序驗證綿羊KLF4的基因組序列。
　?、菢?gòu)建4個攜帶綿羊重編程因子基因序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因傳遞表達載體，分別為pMXs-oPOU5F1、pMXs-oSOX2、pMXs-oKLF4和pMXs-oMYC質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶酶切法和測序法驗證構(gòu)建質(zhì)粒序列的正確性。
　?、葘⒄战M的pMXs-GFP質(zhì)粒和構(gòu)建的4個質(zhì)粒運用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法分別轉(zhuǎn)染入Phoenix Amphotropic細胞系。轉(zhuǎn)染48 h和72 h后，在

13、熒光條件下觀察pMXs-GFP的轉(zhuǎn)染效果，并對培養(yǎng)的新生綿羊的Leydig細胞進行感染。細胞感染4 d后，在熒光條件下觀察pMXs-GFP質(zhì)粒對綿羊Leydig細胞的感染效果，并用RT-PCR法驗證這4個質(zhì)粒攜帶基因的外源表達情況。
　?、?月齡大的小鼠睪丸，剝離白膜后，用膠原酶消化獲得Leydig細胞。Leydig細胞通過HSD3B染色方法鑒定。
　　【結(jié)果】
　?、臥OU5F1在新生的和性成熟的湖羊睪丸中均表達。綿

14、羊POU5F1的mRNA包含了一個1080 bp的開放閱讀框（open reading frame，ORF），編碼了359個氨基酸。綿羊POU5F1含有1個POU結(jié)構(gòu)域和1個homeobox結(jié)構(gòu)域。綿羊POU5F1蛋白第206位的賴氨酸和第207位的纈氨酸的序列是物種特異的，其它的哺乳動物在此對應的賴氨酸和纈氨酸位點之間還有一個色氨酸。
　?、芐OX2在新生的和性成熟的湖羊睪丸中均表達。綿羊SOX2的mRNA含有一個963 bp的

15、ORF，編碼了320個氨基酸。綿羊SOX2含有1個HMG(high mobility group)結(jié)構(gòu)域。
　?、荕YC在新生的綿羊睪丸中表達。綿羊MYC的mRNA包含了一個1320 bp的 ORF，編碼了439個氨基酸。綿羊MYC含有1個 HLH（helix-loop-helix）結(jié)構(gòu)域。
　?、染d羊KLF4基因組從起始密碼子到終止密碼子的序列長度為3159 bp，含有一個1434 bp的ORF，編碼了477個氨基酸的蛋白

16、質(zhì)。綿羊KLF4基因含有4個外顯子和3個內(nèi)含子。綿羊KLF4蛋白在肽鏈的碳端有3個C2H2(cysteine2/histidine2)型的鋅指。POU5F1、SOX2、KLF4和MYC氨基酸序列分析表明綿羊與牛有著最近的進化關(guān)系，與靈長類和嚙齒類有著相對較遠的進化關(guān)系。SOX2和KLF4蛋白的氨基酸序列在綿羊和牛中是100%的一致。
　?、上拗菩詢?nèi)切酶酶切法和測序法驗證了構(gòu)建的pMXs-oPOU5F1、pMXs-oSOX2、pMX

17、s-oKLF4和pMXs-oMYC質(zhì)粒序列的正確性。通過用pMXs-GFP質(zhì)粒做對照，預測這4個構(gòu)建的質(zhì)粒能夠在AMPHO細胞系中有效地轉(zhuǎn)染。RT-PCR結(jié)果表明，這4個逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒攜帶的外源基因均能夠在綿羊 Leydig細胞基因組中整合并轉(zhuǎn)錄。
　　⑹HSD3B染色鑒定后表明，培養(yǎng)48 h的成年小鼠Leydig細胞，在光學顯微鏡下能夠清晰地分辨出Leydig細胞的細胞核與細胞質(zhì)。Leydig細胞的細胞核大而圓；細胞質(zhì)布滿了致密

18、的脂滴，細胞質(zhì)折光性強。Leydig細胞培養(yǎng)5 d后，細胞充分伸展，形態(tài)多樣。一些細胞聚集生長，一些細胞單獨生長。聚集生長的各個細胞通過細胞的觸角（cellular tentacles）相互聯(lián)系，形成了表皮樣的外貌。RT-PCR結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)5 d的Leydig細胞能夠表達Leydig細胞特異的轉(zhuǎn)錄，包括HSD3B6、CYP17A1和StAR。
　　【結(jié)論】新生湖羊的睪丸組織能夠表達POU5F1、SOX2和MYC基因，但不表達

19、KLF4基因。獲得了綿羊POU5F1、SOX2和MYC基因的編碼區(qū)的mRNA序列，以及獲得了蒙古綿羊KLF4的基因組序列。構(gòu)建了有效的攜帶綿羊重編程因子基因序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因傳遞表達載體，分別為pMXs-oPOU5F1、pMXs-oSOX2、pMXs-oKLF4和pMXs-oMYC。鑒定了體外培養(yǎng)的成年小鼠Leydig細胞的生長形態(tài)特征，為將來更好地鑒定體外培養(yǎng)的綿羊Leydig細胞提供技術(shù)基礎(chǔ)。這些研究結(jié)果可為將來獲得綿羊Leydi