SOX2基因在腫瘤中的作用及其分子機理的研究.pdf

1、SOX(SRY-like HMG box)基因家族是一類具有HMG(high mobility group)特征性結(jié)構域的轉(zhuǎn)錄因子家族。HMG是DNA結(jié)合區(qū)域，其基因序列在真核細胞內(nèi)高度保守。目前，共發(fā)現(xiàn)20種SOX基因，分為10個亞類。SOX2是sox家族組中一個主要成員，表達與胚胎干細胞，在胚胎的各個發(fā)育過程中起重要作用。近年來，發(fā)現(xiàn)SOX2是誘導人和鼠成體細胞細胞為pluripotency細胞的一個關鍵和必需的分子。干細胞和腫瘤都

2、具有自我更新等共同特性，在干細胞起關鍵作用的基因在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中也起一定作用。
　　 SOX2已被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中高表達，如肺癌、胰腺癌、乳腺癌和神經(jīng)內(nèi)分泌癌等；在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的早期，SOX2表達于全部的神經(jīng)上皮，但神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育成熟之后，其表達僅局限于胚基的神經(jīng)膠質(zhì)干細胞，而當神經(jīng)膠質(zhì)細胞惡變后，在腦膠質(zhì)瘤中被激活而重新表達，表達顯著高于正常組織，并且在RNA和蛋白水平上得到了證實。文獻報道在結(jié)腸癌中SOX2高表達并且是

3、判斷預后的候選生物標記，并且SOX2的表達與干細胞標記CD133以及對化療藥物抵抗有相關性。然而SOX2結(jié)腸癌中的作用及其分子機理目前尚無研究。
　　 本研究中，我們在結(jié)腸癌細胞中應用基因干涉技術，觀察SOX2基因?qū)毎飳W行為的影響，發(fā)現(xiàn)SOX2基因干涉后其增殖、克隆形成以及動物體內(nèi)致瘤能力明顯降低。我們利用了基因組，轉(zhuǎn)錄組以及蛋白質(zhì)組學技術：基因表達芯片，Chip-Seq( chromatinimmunoprecipita

4、TiO2-sequencin)和Co-IP-MS-MS(ImmunoprecipitaTiO2 coupled with mass spectrometry)，應用系統(tǒng)生物學理念，探討該基因?qū)δ[瘤發(fā)生的分子機理。
　　 1.免疫組織化學檢測SOX2在結(jié)腸癌中的表達
　　 用免疫組織化學檢測30例結(jié)腸癌組織和配對正常結(jié)腸組織SOX2蛋白的表達，結(jié)果表明SOX2在癌組織細胞核中的表達顯著高于正常組織，差異有顯著性。
　

5、　 2.基因干涉技術對SOX2在腫瘤細胞中生物學功能的研究
　　 利用慢病毒介導的基因干涉技術，病毒感染結(jié)腸癌細胞后SOX2的表達顯著下調(diào)，體外功能實驗顯示，SOX2基因基因干涉后細胞增殖能力和克隆形成能力顯著減低，細胞周期呈現(xiàn)S和G2/M期阻滯；動物體內(nèi)致瘤能力也顯著降低。
　　 3.SOX2基因干涉后細胞基因表達譜的改變及生物信息分析
　　 SOX2基因干涉后，通過基因芯片表達譜分析，發(fā)現(xiàn)1205個基因的表

6、達因SOX2基因干涉而下調(diào)；Go Ontology分析，這些下調(diào)的基因參與了數(shù)條重要生物過程，如：cell surface receptor linked signal transducTiO2(GO:0007166),BMP signaling pathway(GO:0030509), response to retinoic acid(GO:0032526)等，說明SOX2可能通過這些基因表達水平的調(diào)節(jié)而調(diào)控這些生物過程。
　

7、　 4.Chip-seq SOX2蛋白分子基因組結(jié)合位點分析
　　 利用Chip-seq技術確定了SOX2在基因組上的結(jié)合位點，并與表達譜芯片整合分析，進一步確定了SOX2在轉(zhuǎn)錄水平上可能直接調(diào)節(jié)的基因；并將SOX2在腫瘤中的結(jié)合位點與在胚胎干細胞中的結(jié)合位點進行比較，兩者共有372個結(jié)合位點，說明Sox2在腫瘤中和在干細胞中對基因的調(diào)節(jié)具有一定的保守性。在結(jié)腸癌細胞中SOX2在基因組DNA上的結(jié)合位點富含AT序列，并且共有一

8、共同motif:wwTGywTT;將SOX2的結(jié)合區(qū)域向兩側(cè)延伸，以發(fā)現(xiàn)SOX2結(jié)合區(qū)域內(nèi)是否含有其他已知轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合motif,結(jié)果發(fā)現(xiàn)了已知的與SOX2有協(xié)同作用的OCT家族蛋白的結(jié)合motif，并且發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合motif如：Fox和HNF等家族蛋白的結(jié)合motif，這說明這些蛋白可能與SOX2共同參與對基因表達的調(diào)節(jié)。
　　 5.Co-IP-MS-MS SOX2相互作用蛋白的鑒定和分析
　　 Co-IP

9、-MS/MS分析共鑒定到與SOX2蛋白相互作用形成復合物的蛋白144個，每個蛋白的可信度都大于0.9，并且每個蛋白在質(zhì)譜中出現(xiàn)的肽段都至少有兩個不同唯一肽段出現(xiàn)。隨機選取了4個蛋白進行westem-blot驗證；我們發(fā)現(xiàn)在鑒定到的蛋白中，有很多蛋白為HnRNP家族蛋白，并與以往鑒定到的HnRNP復合物組分相比較，說明SOX2可能是HnRNP復合物的一個組分，SOX2與這蛋白相互作用參與了基因的表達各個過程的調(diào)節(jié)。
　　 6.整合

10、分析
　　 整合基因表達譜改變、Sox2 DNA結(jié)合位點和Sox2相互作用蛋白，我們發(fā)現(xiàn)在Sox2基因組的結(jié)合區(qū)域存在CEBPB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合motif，在相互作用的蛋白中存在CEBPB蛋白，這說明Sox2可能與和CEBPB共同結(jié)合一個的DNA區(qū)域內(nèi)調(diào)節(jié)基因的表達，這有待于經(jīng)典的生物學進一步驗證。結(jié)論：
　　 SOX2在結(jié)腸癌組織的細胞核中的表達顯著高于正常組織。SOX2基因干涉降低了結(jié)腸癌細胞的體外增殖能力和體內(nèi)致瘤能力

11、，細胞周期呈現(xiàn)S和G2/M期阻滯。SOX2基因干涉后數(shù)條與結(jié)腸癌發(fā)生相關的生物過程中的基因表達下調(diào)。確定了SOX2在基因組上的結(jié)合位點和結(jié)合特征；SOX2在腫瘤細胞中和人胚胎干細胞中共有372個共同的基因組結(jié)合位點，說明Sox2在腫瘤中和在胚胎中對基因的調(diào)節(jié)具有一定的保守性；基因芯片數(shù)據(jù)和Chip-seq數(shù)據(jù)整合分析確定了SOX2可能直接調(diào)節(jié)94個基因的轉(zhuǎn)錄，其中53個基因受SOX2的正調(diào)節(jié)，41個受SOX2的負調(diào)節(jié)。蛋白相互作用分析顯