SOX2基因在腫瘤中的作用及其分子機(jī)理的研究.pdf

1、SOX(SRY-like HMG box)基因家族是一類具有HMG(high mobility group)特征性結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子家族。HMG是DNA結(jié)合區(qū)域，其基因序列在真核細(xì)胞內(nèi)高度保守。目前，共發(fā)現(xiàn)20種SOX基因，分為10個(gè)亞類。SOX2是sox家族組中一個(gè)主要成員，表達(dá)與胚胎干細(xì)胞，在胚胎的各個(gè)發(fā)育過(guò)程中起重要作用。近年來(lái)，發(fā)現(xiàn)SOX2是誘導(dǎo)人和鼠成體細(xì)胞細(xì)胞為pluripotency細(xì)胞的一個(gè)關(guān)鍵和必需的分子。干細(xì)胞和腫瘤都

2、具有自我更新等共同特性，在干細(xì)胞起關(guān)鍵作用的基因在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中也起一定作用。
　　 SOX2已被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中高表達(dá)，如肺癌、胰腺癌、乳腺癌和神經(jīng)內(nèi)分泌癌等；在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的早期，SOX2表達(dá)于全部的神經(jīng)上皮，但神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育成熟之后，其表達(dá)僅局限于胚基的神經(jīng)膠質(zhì)干細(xì)胞，而當(dāng)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞惡變后，在腦膠質(zhì)瘤中被激活而重新表達(dá)，表達(dá)顯著高于正常組織，并且在RNA和蛋白水平上得到了證實(shí)。文獻(xiàn)報(bào)道在結(jié)腸癌中SOX2高表達(dá)并且是

3、判斷預(yù)后的候選生物標(biāo)記，并且SOX2的表達(dá)與干細(xì)胞標(biāo)記CD133以及對(duì)化療藥物抵抗有相關(guān)性。然而SOX2結(jié)腸癌中的作用及其分子機(jī)理目前尚無(wú)研究。
　　 本研究中，我們?cè)诮Y(jié)腸癌細(xì)胞中應(yīng)用基因干涉技術(shù)，觀察SOX2基因?qū)?xì)胞生物學(xué)行為的影響，發(fā)現(xiàn)SOX2基因干涉后其增殖、克隆形成以及動(dòng)物體內(nèi)致瘤能力明顯降低。我們利用了基因組，轉(zhuǎn)錄組以及蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)：基因表達(dá)芯片，Chip-Seq( chromatinimmunoprecipita

4、TiO2-sequencin)和Co-IP-MS-MS(ImmunoprecipitaTiO2 coupled with mass spectrometry)，應(yīng)用系統(tǒng)生物學(xué)理念，探討該基因?qū)δ[瘤發(fā)生的分子機(jī)理。
　　 1.免疫組織化學(xué)檢測(cè)SOX2在結(jié)腸癌中的表達(dá)
　　 用免疫組織化學(xué)檢測(cè)30例結(jié)腸癌組織和配對(duì)正常結(jié)腸組織SOX2蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明SOX2在癌組織細(xì)胞核中的表達(dá)顯著高于正常組織，差異有顯著性。
　

5、　 2.基因干涉技術(shù)對(duì)SOX2在腫瘤細(xì)胞中生物學(xué)功能的研究
　　 利用慢病毒介導(dǎo)的基因干涉技術(shù)，病毒感染結(jié)腸癌細(xì)胞后SOX2的表達(dá)顯著下調(diào)，體外功能實(shí)驗(yàn)顯示，SOX2基因基因干涉后細(xì)胞增殖能力和克隆形成能力顯著減低，細(xì)胞周期呈現(xiàn)S和G2/M期阻滯；動(dòng)物體內(nèi)致瘤能力也顯著降低。
　　 3.SOX2基因干涉后細(xì)胞基因表達(dá)譜的改變及生物信息分析
　　 SOX2基因干涉后，通過(guò)基因芯片表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)1205個(gè)基因的表

6、達(dá)因SOX2基因干涉而下調(diào)；Go Ontology分析，這些下調(diào)的基因參與了數(shù)條重要生物過(guò)程，如：cell surface receptor linked signal transducTiO2(GO:0007166),BMP signaling pathway(GO:0030509), response to retinoic acid(GO:0032526)等，說(shuō)明SOX2可能通過(guò)這些基因表達(dá)水平的調(diào)節(jié)而調(diào)控這些生物過(guò)程。
　

7、　 4.Chip-seq SOX2蛋白分子基因組結(jié)合位點(diǎn)分析
　　 利用Chip-seq技術(shù)確定了SOX2在基因組上的結(jié)合位點(diǎn)，并與表達(dá)譜芯片整合分析，進(jìn)一步確定了SOX2在轉(zhuǎn)錄水平上可能直接調(diào)節(jié)的基因；并將SOX2在腫瘤中的結(jié)合位點(diǎn)與在胚胎干細(xì)胞中的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行比較，兩者共有372個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，說(shuō)明Sox2在腫瘤中和在干細(xì)胞中對(duì)基因的調(diào)節(jié)具有一定的保守性。在結(jié)腸癌細(xì)胞中SOX2在基因組DNA上的結(jié)合位點(diǎn)富含AT序列，并且共有一

8、共同motif:wwTGywTT;將SOX2的結(jié)合區(qū)域向兩側(cè)延伸，以發(fā)現(xiàn)SOX2結(jié)合區(qū)域內(nèi)是否含有其他已知轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合motif,結(jié)果發(fā)現(xiàn)了已知的與SOX2有協(xié)同作用的OCT家族蛋白的結(jié)合motif，并且發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合motif如：Fox和HNF等家族蛋白的結(jié)合motif，這說(shuō)明這些蛋白可能與SOX2共同參與對(duì)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。
　　 5.Co-IP-MS-MS SOX2相互作用蛋白的鑒定和分析
　　 Co-IP

9、-MS/MS分析共鑒定到與SOX2蛋白相互作用形成復(fù)合物的蛋白144個(gè)，每個(gè)蛋白的可信度都大于0.9，并且每個(gè)蛋白在質(zhì)譜中出現(xiàn)的肽段都至少有兩個(gè)不同唯一肽段出現(xiàn)。隨機(jī)選取了4個(gè)蛋白進(jìn)行westem-blot驗(yàn)證；我們發(fā)現(xiàn)在鑒定到的蛋白中，有很多蛋白為HnRNP家族蛋白，并與以往鑒定到的HnRNP復(fù)合物組分相比較，說(shuō)明SOX2可能是HnRNP復(fù)合物的一個(gè)組分，SOX2與這蛋白相互作用參與了基因的表達(dá)各個(gè)過(guò)程的調(diào)節(jié)。
　　 6.整合

10、分析
　　 整合基因表達(dá)譜改變、Sox2 DNA結(jié)合位點(diǎn)和Sox2相互作用蛋白，我們發(fā)現(xiàn)在Sox2基因組的結(jié)合區(qū)域存在CEBPB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合motif，在相互作用的蛋白中存在CEBPB蛋白，這說(shuō)明Sox2可能與和CEBPB共同結(jié)合一個(gè)的DNA區(qū)域內(nèi)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，這有待于經(jīng)典的生物學(xué)進(jìn)一步驗(yàn)證。結(jié)論：
　　 SOX2在結(jié)腸癌組織的細(xì)胞核中的表達(dá)顯著高于正常組織。SOX2基因干涉降低了結(jié)腸癌細(xì)胞的體外增殖能力和體內(nèi)致瘤能力

11、，細(xì)胞周期呈現(xiàn)S和G2/M期阻滯。SOX2基因干涉后數(shù)條與結(jié)腸癌發(fā)生相關(guān)的生物過(guò)程中的基因表達(dá)下調(diào)。確定了SOX2在基因組上的結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合特征；SOX2在腫瘤細(xì)胞中和人胚胎干細(xì)胞中共有372個(gè)共同的基因組結(jié)合位點(diǎn)，說(shuō)明Sox2在腫瘤中和在胚胎中對(duì)基因的調(diào)節(jié)具有一定的保守性；基因芯片數(shù)據(jù)和Chip-seq數(shù)據(jù)整合分析確定了SOX2可能直接調(diào)節(jié)94個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄，其中53個(gè)基因受SOX2的正調(diào)節(jié)，41個(gè)受SOX2的負(fù)調(diào)節(jié)。蛋白相互作用分析顯