Sox2、Pax6對ErbB家族基因調(diào)控機制的研究.pdf

1、目的：干細胞與腫瘤干細胞特性之間既有相同也有不同，其生物學行為都受到類似的內(nèi)在基因調(diào)控和外在局部微環(huán)境的雙重影響。轉(zhuǎn)錄因子和生長因子及其受體是這種雙重調(diào)控的兩個重要方面，研究它們之間的相互關(guān)系、并比較這種調(diào)控機制在正常干細胞與腫瘤干細胞之間的異同具有重要意義。表皮生長因子受體（Epithelial Growth Factor Receptor，EGFR）是正常神經(jīng)干細胞增殖過程所必須的生長因子；它屬于ErbB基因家族，有四個成員ErbB

2、1（EGFR）、ErbB2（HER2）、ErbB3和ErbB4，EGFR和ErbB家族的其它成員不僅在干細胞中有表達，在腫瘤細胞中也也具有多種重要的生物學作用，但調(diào)控ErbB受體家族的轉(zhuǎn)錄因子仍然有許多未知，它們的表達調(diào)控機制在干細胞和腫瘤干細胞中又有哪些相同點和不同點也不清楚。本文將就調(diào)控ErbB家族受體的轉(zhuǎn)錄因子以及它們在正常干細胞與腫瘤干細胞之間的異同進行初步的研究。
　　根據(jù)我們的前期工作，有兩類轉(zhuǎn)錄因子可能對ErbB家族

3、受體的轉(zhuǎn)錄調(diào)控起重要的作用。第一個是Sox基因（SRYrelated HMG-Boxgenes）家族，Sox基因是一類與干細胞的特性與細胞分化非常重要的轉(zhuǎn)錄因子。Sox2是干細胞的特異標志，參與干細胞增殖的調(diào)節(jié)和多項分化潛能的維持。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，Sox2能夠通過調(diào)節(jié)EGFR的mRNA轉(zhuǎn)錄表達影響神經(jīng)干細胞的自我復制和增殖，因此，我們提出以下問題：（1）在腫瘤干細胞或腫瘤細胞及其他類型的干細胞中是否也存在Sox2調(diào)節(jié)EGFR的機制

4、？（2）Sox2對ErbB家族各成員之間是否均存在類似的調(diào)控關(guān)系？第二個轉(zhuǎn)錄因子是Pax6（pairedbox6），Pax6是調(diào)節(jié)神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它和EGF-應(yīng)答的神經(jīng)干細胞的發(fā)育可能有直接的關(guān)系，那么，Pax6和EGF以及EGFR之間有什么調(diào)節(jié)關(guān)系呢？如果有，對神經(jīng)干細胞的又起什么樣的作用呢？進一步，在腫瘤干細胞，特別是神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤干細胞的發(fā)生和發(fā)展過程中，是否也存在類似的機制呢？
　　論文將分為兩部分，

5、第一部分：Sox2對ErbB家族基因調(diào)控機制的研究；第二部分：Pax6對EGFR基因調(diào)控機制的研究。下面也將分成兩部分論述。
　　第一部分：Sox2對ErbB家族基因調(diào)控機制的研究
　　方法：體外包裝Sox2表達質(zhì)粒和重組腺病毒，以空載腺病毒和Sox10表達腺病毒為對照，轉(zhuǎn)染乳腺癌MCF-7細胞系、神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細胞系和骨髓間充質(zhì)干細胞（MSC）：利用Real-TimePCR方法檢測ErbB基因家族各成員（EGFR、Erb

6、B2、ErbB3、ErbB4）、及腫瘤干細胞相關(guān)標志CD133，和神經(jīng)膠質(zhì)細胞標志（S100b、p75NTR、nestin、GFAP、olig2）等基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化；免疫熒光（Immunocytochemistry）和Western-blot分析蛋白表達水平的變化；雙報告基因檢測方法測定Sox2對ErbB家族基因的調(diào)控關(guān)系。
　　結(jié)果：（1）轉(zhuǎn)染Sox2過表達腺病毒到MCF-7細胞系中，ErbB2和ErbB3的mRNA轉(zhuǎn)錄

7、水平明顯增加，CD133-mRNA轉(zhuǎn)錄也有增加趨勢，EGFR和ErbB4的mRNA轉(zhuǎn)錄未見明顯變化；在U87細胞系和MSC細胞中轉(zhuǎn)染Sox2過表達腺病毒后，EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4、CD133、S100b、p75NTR、nestin、GFAP、olig2等基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平均未見到顯著變化；Immunocytochemistry觀察：在MCF-7細胞中轉(zhuǎn)染Sox2過表達腺病毒，Sox2可分別與ErbB2和ErbB3

8、出現(xiàn)共表達，Sox2蛋白在細胞核中表達，而ErbB2和ErbB3蛋白的表達主要集中在細胞膜，胞漿中少量表達，此外，在新增殖的MCF-7細胞中，ErbB2和ErbB3也有表達；Westernblot分析：盡管在MCF-7細胞中Sox2和ErbB2都有本底水平的表達，但隨Sox2表達增加，ErbB2的表達也明顯增加，而轉(zhuǎn)染空載腺病毒組和Sox10腺病毒組未見到這一變化；報告基因檢測系統(tǒng)分析：Sox2上調(diào)ErbB2、ErbB3基因啟動子區(qū)介導

9、的熒光素酶表達活性，并且這種表達隨Sox2質(zhì)粒濃度的增加而增強。
　　結(jié)論：在ErbB2和ErbB3基因啟動子區(qū)存在Sox2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點；Sox2可能直接上調(diào)MCF-7細胞中ErbB2、ErbB3受體的表達。
　　第二部分：Pax6對EGFR基因調(diào)控機制的研究
　　方法：（1）利用Pax6基因突變小鼠做為動物模型，解剖取出野生型（WT）和Pax6基因突變型（mutant）胎鼠的背側(cè)皮層，在體外做神經(jīng)干細胞克隆成球培養(yǎng)

10、。用96孔板法進行克隆成球率實驗，并比較兩種神經(jīng)球的EGFR的蛋白及mRNA表達水平的變化。（2）利用表達EGFR的腺病毒轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細胞，觀察其對神經(jīng)干細胞的突起生長的影響。
　　結(jié)果：（1）利用Pax6基因突變小鼠做為動物模型，研究發(fā)現(xiàn)：野生型（WT）和Pax6基因突變型（mutant）神經(jīng)干細胞克隆球在大小形態(tài)上無明顯差異，但Pax6基因突變型小鼠神經(jīng)球克隆數(shù)比野生型小鼠少，EGFR-mRNA轉(zhuǎn)錄水平下降，蛋白表達降低；（2）