P300和PAX6在人乳腺癌中的功能研究.pdf

1、第一章ChIP-seq數(shù)據(jù)分析P300在乳腺癌細(xì)胞中的結(jié)合位點(diǎn)
　　目的：為了揭示雌二醇（estrogen, E2）刺激前后乳腺癌細(xì)胞MCF7中P300結(jié)合位點(diǎn)的分布特征，篩選受雌激素受體信號(hào)激活的P300調(diào)控基因，確定P300及其調(diào)控基因在乳腺癌中的相關(guān)作用機(jī)制。
　　方法：以E2刺激前后人類乳腺癌細(xì)胞MCF7中P300增強(qiáng)子結(jié)合蛋白的ChIP-seq數(shù)據(jù)（GSE39623）為基礎(chǔ)，首先分析了E2刺激前后P300結(jié)合位點(diǎn)在

2、染色體上的分布情況，以及結(jié)合位點(diǎn)信號(hào)變化的差異。通過(guò)對(duì)P300結(jié)合位點(diǎn)周圍基因的檢測(cè)，對(duì)P300調(diào)控的靶基因進(jìn)行了分析，進(jìn)而結(jié)合GO數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)這些靶基因進(jìn)行了功能富集分析。此外，我們還確定了E2刺激前后與P300結(jié)合信號(hào)顯著增強(qiáng)的特異性靶基因，并同時(shí)進(jìn)行了GO功能富集分析。最后我們分別對(duì)E2刺激前后特異性的P300結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了Motif finding分析,并對(duì)E2刺激后新出現(xiàn)能夠與P300發(fā)生共定位的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了GO功能富集分析。<

3、br>　　結(jié)果：乳腺癌細(xì)胞MCF7中P300的結(jié)合位點(diǎn)主要集中在5’ UTR區(qū)域、3’ UTR區(qū)域、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)兩側(cè)，而E2刺激后P300結(jié)合位點(diǎn)在TSS區(qū)域的分布密度出現(xiàn)少量上升。在E2刺激后確定的24899個(gè)差異P300結(jié)合位點(diǎn)中，39％位點(diǎn)的結(jié)合信號(hào)顯著上升。E2刺激前 P300調(diào)控的靶基因主要富集在與神經(jīng)細(xì)胞分化相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程，而E2刺激后富集在細(xì)胞連接、細(xì)胞粘附等過(guò)程的靶基因顯著增多。此外，針對(duì)結(jié)合信號(hào)顯著增強(qiáng)

4、的P300調(diào)控靶基因功能富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩組靶基因均與神經(jīng)分化的功能相關(guān)，而E2刺激后細(xì)胞運(yùn)動(dòng)功能出現(xiàn)了大量基因的富集。最后，我們?cè)贓2刺激前后P300結(jié)合位點(diǎn)周圍分別找到了225和176個(gè)Motif富集顯著水平較高的轉(zhuǎn)錄因子。功能富集分析結(jié)果顯示P300共定位轉(zhuǎn)錄因子主要富集在細(xì)胞增殖、分化、遷移等生物學(xué)過(guò)程。此外我們發(fā)現(xiàn)雌激素受體信號(hào)通路相關(guān)因子ESR1、BRCA1也能夠與P300發(fā)生共定位。
　　結(jié)論：P300在乳腺癌中發(fā)

5、揮了廣泛的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，并與雌激素受體信號(hào)通路之間存在明顯的相關(guān)性。
　　第二章PAX6和P300在人乳腺癌細(xì)胞和組織中的表達(dá)
　　目的：為了揭示P300和PAX6在人乳腺癌細(xì)胞及組織中的表達(dá)情況。
　　方法：本研究首先采用定量PCR的方法檢測(cè)了PAX6及P300在人乳腺上皮細(xì)胞株HBL-100，人乳腺癌細(xì)胞株BT-474、MDA-MB-231、MCF-7中的表達(dá)水平。進(jìn)而通過(guò)收集經(jīng)手術(shù)切除臨床雌激素受體陽(yáng)性淋巴轉(zhuǎn)移人

6、乳腺癌組織樣本30例，雌激素受體陽(yáng)性無(wú)轉(zhuǎn)移人乳腺癌組織樣本30例以及相應(yīng)的癌旁組織（非癌組織），同樣采用定量 PCR的方法檢測(cè)了PAX6及P300在這些組織中的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：PAX6在人乳腺癌細(xì)胞系BT-474中高表達(dá)，而相對(duì)的乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、MCF-7中的表達(dá)較低（P<0.01）。P300則在三種乳腺癌細(xì)胞系中高表達(dá)（P<0.01）。P300和PAX6在癌旁組織（非癌組織）中的表達(dá)低于相應(yīng)的癌組織（P<

7、0.05），且轉(zhuǎn)移乳腺癌組織樣本中P300和PAX6的表達(dá)明顯高于非轉(zhuǎn)移乳腺癌組織（P<0.05）。
　　結(jié)論：PAX6和P300在乳腺癌中均高表達(dá)，且與乳腺癌的轉(zhuǎn)移能力相關(guān)。
　　第三章P300基因敲除對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力的影響。
　　目的：為了揭示P300對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖、凋亡、侵襲及遷移能力的影響。
　　方法：本研究通過(guò)化學(xué)合成構(gòu)建了3組 siRNA片段（siP300-1， siP30

8、0-2及siP300-3）用于P300的沉默。轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞MCF-7后，我們首先通過(guò)定量PCR檢測(cè)了該3組片段對(duì)P300的沉默效率，以及對(duì)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因MMP9、VEGF和uPA表達(dá)的影響。接著通過(guò)Western blot驗(yàn)證了siP300-1對(duì)P300以及PAX6表達(dá)的影響。隨后通過(guò)CCK-8、流式細(xì)胞儀檢測(cè)了三組片段對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖及凋亡的影響，并通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)以及Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了siP300-1對(duì)乳

9、腺癌細(xì)胞MCF-7侵襲及遷移能力的影響。
　　結(jié)果：siP300-1，siP300-2及siP300-3都可以明顯抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7中 P300的表達(dá)，但各組 siRNA的抑制效果有所不同。siRNA轉(zhuǎn)染3天后，siP300-1，siP300-2及siP300-3均表現(xiàn)出明顯抑制MCF-7細(xì)胞活性的能力（P<0.05）。siRNA處理2天后，NC、siP300-1、siP300-2及siP300-3組細(xì)胞的凋亡率分別為18.

10、22%、18.60%、21.94%、17.94%，組間無(wú)顯著差異。P300沉默后，腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移基因MMP9、VEGF和uPA的表達(dá)明顯受到抑制（P<0.05），并且明顯減緩的愈合程度以及減少的細(xì)胞數(shù)目都進(jìn)一步說(shuō)明了乳腺癌細(xì)胞MCF-7的侵襲及遷移能力受到了抑制。此外乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中PAX6的表達(dá)也受到了siP300-1的抑制。
　　結(jié)論：siRNA可以有效的抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7中P300的表達(dá)，并進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞MC