SOX2在肺癌發(fā)生和細胞凋亡中作用機制的研究.pdf

1、在世界范圍內(nèi)，肺癌的發(fā)病率呈持續(xù)增高的趨勢并且居男女腫瘤病死率的首位。據(jù)統(tǒng)計2009和2010年，在所有腫瘤中肺癌的發(fā)病率和病死率仍然最高[1-2]，大部分的肺癌病人在初次確診時已經(jīng)處于癌癥的晚期，因此造成了肺癌的高病死率[3]。2011年美國有221，130例新發(fā)肺癌病人以及有156，940例肺癌病人死亡[4]。在病理分型上，肺癌被劃分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌(腺癌、鱗癌和大細胞肺癌)，這一病理分型為治療策略的選擇和預后的評判提供參

2、考的依據(jù)。非小細胞肺癌(NSCLC)占肺癌的比例超過85％，在初次確診時大多數(shù)病人的原位腫瘤已經(jīng)為晚期并伴有腫瘤轉(zhuǎn)移，而其中肺腺癌占非小細胞肺癌約60%-70%的比例。手術(shù)切除腫瘤是對于早期非小細胞肺癌治療的主要手段[5]，而對于不能手術(shù)切除腫瘤的病人，通常采用放療和化療的辦法。對于小細胞肺癌而言化療是主要的治療方式，對一些處于特定臨床分期的腫瘤也采取合并放療的方式[5]。許多研究表明在小細胞肺癌和非小細胞肺癌中都存在腫瘤干細胞樣細胞[

3、6-26]。這些肺癌干細胞具有高克隆形成性，可以形成腫瘤并且對化療放療都具有抵抗性。與其他許多癌癥類似，肺癌的發(fā)病也由于癌基因的激活，或抑癌基因的失活[27]。肺癌細胞的異常生長是一個多基因參與，涉及復雜的基因網(wǎng)絡調(diào)控的過程，然而基因參與腫瘤生長并且在肺癌干細胞中的分子調(diào)控機制并不明確。因此，對肺癌分子調(diào)控機制的深入研究可提高肺癌病人的治療質(zhì)量。
　　 性別決定區(qū)域Y基因2(sex determining region Y-bo

4、x2，SOX2)，參與維持胚胎干細胞的多能性[28-29]，并且在多種器官發(fā)育過程中發(fā)揮作用，包括參與肺支氣管的形成[30]。在腫瘤基因表達的研究中，分析在發(fā)育和分化中激活的基因結(jié)果表明，SOX2在低分化的腫瘤中高表達[31-32]。
　　 本文以SOX2為研究對象，通過各種實驗手段，一方面闡明了SOX2分子在肺癌發(fā)生中的重要作用，參與調(diào)控肺癌干細胞生長及其調(diào)節(jié)的分子機制。另一方面，在觀察到沉默SOX2分子可引起肺癌細胞發(fā)生顯著

5、凋亡的基礎上，進而深入的研究了其調(diào)控凋亡的分子機制。這些發(fā)現(xiàn)為我們研制以SOX2為靶點的可應用于肺癌治療的有效藥物奠定了堅實的基礎。
　　 首先，我們利用免疫組織化學染色的方法，對臨床肺癌和正常肺組織標本進行了染色，分析SOX2在肺癌臨床標本中的表達情況，發(fā)現(xiàn)SOX2在肺癌組織中的表達顯著高于正常的肺組織，這一結(jié)果提示我們，SOX2在肺癌的發(fā)生中起重要的作用。
　　 其次，我們利用Hoechst33342對A549細胞進

6、行染色并經(jīng)過流式細胞儀分選，分析SOX2在人肺癌細胞A549的側(cè)群細胞中的表達，在RNA和蛋白水平都檢測出SOX2的表達在側(cè)群細胞中明顯高于非側(cè)群細胞，說明SOX2在維持肺癌干細胞的特性中發(fā)揮了重要的作用。
　　 通過上述實驗結(jié)果，我們初步明確了SOX2在肺癌發(fā)生和維持肺癌干細胞特性中的作用。我們進一步通過慢病毒系統(tǒng)建立了可經(jīng)Doxycycline誘導沉默SOX2的穩(wěn)定細胞系，并運用NOD/SCID免疫缺陷小鼠建立了肺癌體內(nèi)模型

7、，探討了SOX2在肺癌發(fā)生和凋亡中的作用及其分子機制。
　　 主要實驗結(jié)果如下：
　　 1.沉默SOX2可顯著下調(diào)A549細胞中側(cè)群細胞的比例，并且導致在側(cè)群細胞中高表達的癌基因WNT1、WNT2、NOTCH1和c-MYC的表達量都明顯下降，這一分子調(diào)控的變化在另一株人肺癌細胞系H460中可得到相同的結(jié)果，
　　 2.利用體內(nèi)成像系統(tǒng)，連續(xù)動態(tài)的對小鼠體內(nèi)肺癌細胞生長進行觀察，沉默SOX2可顯著抑制肺癌的發(fā)生，并

8、且肺組織切片染色結(jié)果顯示，癌基因WNT1、WNT2、NOTCH1和c-MYC在沉默SOX2實驗組的肺癌組織中的表達量都明顯下降。
　　 3.通過基因芯片分析，發(fā)現(xiàn)沉默SOX2可調(diào)控246個癌基因的表達發(fā)生變化，進一步揭示了SOX2在肺癌發(fā)生中的潛在分子機制。
　　 4.沉默SOX2可引起肺癌細胞系A549、H460和H1299細胞死亡，通過AnnexinⅤ和PI染色結(jié)果可知細胞發(fā)生了明顯的凋亡。
　　 5.通過凋

9、亡蛋白芯片分析，結(jié)合Western Blot結(jié)果驗證，沉默SOX2引發(fā)的凋亡是通過調(diào)控了凋亡的線粒體途徑和死亡受體途徑共同作用發(fā)生的，并且SOX2調(diào)控表達變化最為顯著的蛋白是p53的表達和磷酸化水平的上調(diào)、Bax和Bad分子的表達增加，caspase3和caspase8分子的激活。
　　 6.Real-time PCR和Western Blot結(jié)果顯示，沉默SOX2可引起RAS/MAP激酶通路的分子表達量上調(diào)，并且激活凋亡通路中

10、的兩個重要的誘發(fā)因子p53和TNFα，并且下調(diào)Survivin的表達。
　　 7.在沉默SOX2的同時沉默RAS或MAP4K4分子或者過表達Survivin都能明顯的抑制凋亡發(fā)生的程度，經(jīng)AnnexinⅤ和PI染色結(jié)果可知，發(fā)生凋亡的細胞比例明顯下降。
　　 8.對人肺癌組織芯片的免疫組化染色結(jié)果可知，SOX2的蛋白表達水平與Survivin的表達水平呈正相關(guān)。
　　 9.小鼠體內(nèi)實驗證實，沉默SOX2可引起已形

11、成的肺腫瘤細胞發(fā)生顯著的凋亡，并且引起與體外實驗結(jié)果一致的p53、Survivin和TNFα表達量的變化。
　　 主要實驗結(jié)論如下：
　　 1.SOX2在肺癌發(fā)生和凋亡信號通路中具有重要作用，并且可與Survivin共同作為標志物應用于腫瘤診斷。
　　 2.SOX2是通過調(diào)控肺癌側(cè)群細胞中的癌基因的表達進而起到調(diào)控肺癌發(fā)生作用。
　　 3.SOX2調(diào)節(jié)肺癌細胞凋亡的分子機制是通過調(diào)控RAS-MAP4K4-