Prox1在肺癌細(xì)胞中的作用機(jī)制研究.pdf

1、前言:
　　 肺癌是最常見的肺部原發(fā)性惡性腫瘤,世界各國,特別是工業(yè)發(fā)達(dá)的國家,肺癌的發(fā)病率和死亡率均迅速上升,目前排名世界癌癥死因第一名。肺癌的發(fā)病機(jī)制和病因亦成為人們研究的熱點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄因子Proxl是一種果蠅prospero同源基因,人類.Proxl基因位于人染色體1q32.2～1q32.3,長度約為58kb,至少含有5個(gè)外顯子,編碼83kD蛋白,在細(xì)胞發(fā)育分化及機(jī)體器官形成過程中起關(guān)鍵性作用,在正常胚胎眼晶體、肝臟、神經(jīng)元發(fā)

2、育過程中Prox1的地位至關(guān)重要。
　　 轉(zhuǎn)錄因子Prox1是淋巴管生成最基本的調(diào)控因子,是淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)記物,基因剔除Prox1后淋巴管生成受阻。血管內(nèi)皮異位表達(dá)prox1可誘導(dǎo)淋巴特異基因表達(dá)。此前有研究顯示在腸道腫瘤中轉(zhuǎn)錄因子Prox1表達(dá)與腫瘤分化程度有關(guān)。Prox1表達(dá)高的腫瘤預(yù)后更加不良,體外RNA干擾特異性敲除Proxl基因使細(xì)胞增殖明顯減少,而過表達(dá)Prox1則可明顯的促進(jìn)腫瘤增殖。
　　 本實(shí)

3、驗(yàn)通過檢測(cè)Prox1在肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況,分析Prox1在肺癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中所發(fā)揮的作用。通過轉(zhuǎn)染正義和反義Prox1,檢測(cè)肺癌侵襲和遷移活動(dòng)能力的變化。結(jié)果顯示:Prox1在非小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞核和細(xì)胞漿共表達(dá),而在小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中主要在核表達(dá),并呈強(qiáng)陽性。Prox1表達(dá)增加時(shí)能促進(jìn)肺癌侵襲遷移,表達(dá)減少時(shí)侵襲遷移作用受到抑制,并且Prox1表達(dá)變化時(shí)Rho蛋白表達(dá)水平也隨之變化,Prox1表達(dá)和RhoA,RhoC表達(dá)呈正相關(guān),和R

4、hoB表達(dá)呈負(fù)相關(guān),由于Rho蛋白在調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架,粘附和侵襲遷移運(yùn)動(dòng)中起到一定作用,因此我們推測(cè),轉(zhuǎn)錄因子Prox1促進(jìn)肺癌的遷移和侵襲有可能是通過Rho蛋白發(fā)揮作用的,并且Prox1參與調(diào)節(jié)RhoB,RhoC的轉(zhuǎn)錄活性。與此同時(shí),Prox1還有可能促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖能力,其相關(guān)機(jī)制仍需深入討論。
　　 材料與方法:
　　 1、主要材料與試劑:
　　 細(xì)胞系:人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549,人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446

5、r>　　 主要抗體:Prox1antibody:英國ABCAM公司rabbitpolyclonal;RhoA,RhoB,RhoCantibodies:美國PROTEINTECH公司rabbitpolyclonal;CyclinA,CyclinB1,CyclinD1antibodies:美國CellSignaling
　　 相關(guān)試劑:
　　 Trizol試劑購自lnvitrogen公司,RT-PCR試劑盒購自北京全式金生

6、物技術(shù)有限公司,realtime-PCR試劑盒購自TAKARA公司,Transweli小室購自美國ComingCostar公司,Matrigel基質(zhì)膠購于BD公司,轉(zhuǎn)染試劑:HiPerFectTransfectionReagent和AttracteneTransfectionReagent購自德國QIAGEN公司,CHIPassaykit:Beyotime,Beijing
　　 2、實(shí)驗(yàn)方法:
　　 (1)細(xì)胞培養(yǎng)

7、>　　 將A549,H446細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM和1640培養(yǎng)基37℃,5%CO2孵箱孵育,1-2d換新鮮培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞長滿瓶底后,用0.25%胰酶消化,進(jìn)行傳代。
　　 (2)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
　　 細(xì)胞培養(yǎng)后按照QIANGENE實(shí)驗(yàn)說明步驟進(jìn)行
　　 (3)westemblot雜交
　　 (4)提取細(xì)胞總RNA
　　 (5)RT-PCR:根據(jù)北京TRANSGENG試劑盒步驟RT-PCR

8、
　　 (6)realtime-PCR:大連TAKARA公司qPCR試劑盒
　　 (7)Transwell遷移實(shí)驗(yàn)
　　 (8)劃痕試驗(yàn)
　　 (9)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)
　　 (10)細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)
　　 (11)染色質(zhì)免疫共沉淀:按照Beyotime試劑盒步驟進(jìn)行,RT-PCR檢測(cè)結(jié)果。
　　 (12)統(tǒng)計(jì)分析
　　 結(jié)果:
　　 1、Prox1調(diào)節(jié)肺癌

9、細(xì)胞增殖；
　　 2、Prox1表達(dá)與肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力相關(guān)；
　　 3、Prox1表達(dá)與Rho蛋白相關(guān)。
　　 結(jié)論:
　　 1、轉(zhuǎn)錄因子Prox1促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖;
　　 2、Prox1與肺癌細(xì)胞的侵襲遷移能力相關(guān),Prox1表達(dá)上調(diào)促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移,下調(diào)Prox1抑制肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移;
　　 3、Prox1表達(dá)與Rho蛋白相關(guān),Prox1表達(dá)與RhoA,RhoC正相