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1、目的與意義: 隨著對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)認(rèn)識(shí)的深入,MMPs在腫瘤生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用越來(lái)越引起人們的重視。目前, 應(yīng)用MMPs抑制劑治療腫瘤已成為腫瘤研究的新方向。多西環(huán)素(DOX,一種半合成四環(huán)素族抗生素)是MMPs 抑制劑的一種,因其毒性小、半衰期長(zhǎng)而研究較為廣泛。 本課題通過(guò)研究DOX對(duì)肺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移特性的影響及相關(guān)機(jī)制的研究,為肺癌的治療提供一個(gè)新的方法與手段。 方法:
2、 應(yīng)用MTT比色法觀察DOX 對(duì)A549細(xì)胞體外增殖的影響;應(yīng)用透射電鏡、熒光顯微鏡、DNA瓊脂糖凝膠電泳、流式細(xì)胞儀研究DOX 對(duì)A549細(xì)胞的促凋亡作用;通過(guò)細(xì)胞體外粘附試驗(yàn)、劃痕試驗(yàn)、侵襲試驗(yàn)、裸鼠人工肺轉(zhuǎn)移模型等的方法研究DOX 對(duì)A549細(xì)胞的粘附、侵襲和移動(dòng)力可能存在的作用;通過(guò)明膠底物SDS-PAGE凝膠電泳、RT-PCR、Western Blot觀察DOX 對(duì)明膠酶活性、表達(dá)的影響;應(yīng)用免疫組化的方法觀察DOX 對(duì)A
3、549細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響。并應(yīng)用RT-PCR、Western Blot觀察DOX 對(duì)c-fos, c-junmRNA及蛋白表達(dá)的影響。 結(jié)果: 1. 5 mg/L以上的DOX可以抑制A549細(xì)胞增殖(P < 0.01),該抑制作用呈時(shí)間劑量依賴效應(yīng)。而2.5mg/L的DOX 作用不著(P > 0.05)。 2. 20、40mg/L的DOX作用48h后,電鏡及熒光顯微鏡顯示:A549細(xì)胞出現(xiàn)體積縮小,染色質(zhì)
4、邊集,凋亡小體形成等細(xì)胞凋亡現(xiàn)象;DNA瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)典型的梯狀條帶,DOX劑量越大,條帶越明顯;AnnexinV-PI雙染顯示:0、10、20、40mg/L DOX作用后,細(xì)胞凋亡率分別為2.22%、5.86%、12.6%、20.59%。 3. 2.5、5、10mg/L的DOX作用48h后,其粘附率分別為81.6%、67.2%、55.3%,而對(duì)照組為96%。作用24h后,2.5、5、10mg/L的DOX對(duì)A549細(xì)胞在M
5、atrigel上的移動(dòng)抑制率分別為3.7%、10.8%、18.2%;作用48h后,其移動(dòng)抑制率分別為5.8%、20.2%、35.8%;5、10mg/L的DOX可以抑制A549細(xì)胞在Matrigel上侵襲,其侵襲抑制率分別為12%、33%,而2.5 mg/L DOX對(duì)其無(wú)明顯影響(P>0.05)。應(yīng)用30mg/kg/dDOX處理的裸鼠肺轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)數(shù)顯著低于對(duì)照組。DOX組和對(duì)照組裸鼠肺表面轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)數(shù)分別為74±19個(gè)和15±35個(gè),其轉(zhuǎn)
6、移抑制率達(dá)79%。 4. 2.5、5、10mg/L的DOX均可不同程度的抑制A549細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)的活性,在10mg/L時(shí)尤為顯著。10mg/L的DOX可抑制A549細(xì)胞MMP2的mRNA合成及蛋白表達(dá)。 5.10mg/L的DOX體外可以抑制A549細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vacularendothelial growth factor, VEGF)的表達(dá)。應(yīng)用30mg/kg/dDOX處理的裸鼠肺轉(zhuǎn)移
7、瘤中VEGF的表達(dá)明顯低于對(duì)照組。 6.10mg/L的DOX可以抑制A549細(xì)胞c-jun mRNA及蛋白表達(dá)。 結(jié)論: 1.藥用劑量DOX可以抑制A549細(xì)胞體外增殖,大劑量可促其凋亡; 2.藥用劑量的DOX即可抑制A549細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)Matrigel的粘附、移動(dòng)及侵襲;安全劑量DOX可減少裸鼠肺轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)形成; 3.藥用劑量的DOX可以抑制A549細(xì)胞MMP2的活性、表達(dá);DOX抑制A
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