顆粒溶素與穿孔素的表達及其對肺癌細胞影響的研究.pdf

1、顆粒溶素(Granulysin,GNLY)和穿孔素(Perforin,PFP)是存在于NK細胞和CTL細胞中的細胞毒蛋白,廣泛參與機體抗病原微生物感染和抗腫瘤免疫,有望成為理想的抗腫瘤、抗結核藥物。顆粒溶素和穿孔素的表達與癌癥、感染、器官移植等多種疾病都有密切關系,深入進行顆粒溶素和穿孔素的研究對許多重大疾病的診斷及治療都有非常重要的意義。本實驗運用基因工程的方法體外獲取顆粒溶素和穿孔素基因片段,利用原核表達體系合成不同分子量的顆粒溶素

2、融合蛋白,為顆粒溶素的后續(xù)研究創(chuàng)造條件；構建顆粒溶素和穿孔素真核共表達載體并轉染人肺腺癌A549細胞,體外觀察顆粒溶素和穿孔素在肺癌細胞中的表達情況,為進一步探索顆粒溶素和穿孔素在腫瘤治療中的應用提供依據(jù)。
　　 主要研究方法及結果:
　　 1.體外分離并培養(yǎng)外周血單個核細胞,抽提總RNA,RT-PCR擴增人顆粒溶素和穿孔素基因片段,將其插入pMD18-T構建克隆載體,測序結果表明人顆粒溶素和穿孔素基因片段與Genban

3、k中序列一致,構建了pMD-GNLY和pMD-PFP。
　　 2.構建原核表達質(zhì)粒pET-GNLY9K和pET-GNLY15K,將重組質(zhì)粒轉入大腸桿菌Rosetta(DE3),經(jīng)IPTG誘導在原核表達系統(tǒng)中高效表達了相應分子質(zhì)量約為31和37kD的融合蛋白,Western-blotting結果表明重組顆粒溶素融合蛋白能與羊抗人顆粒溶素抗體發(fā)生良好的抗原抗體反應。
　　 3.以FMDV2A代替IRES,構建真核共表達載體p

4、GNLY-2A-PFP并轉染人肺癌A549細胞,RT-PCR和間接免疫熒光檢測目的蛋白表達,流式細胞AnnexinV/PI檢測轉染后細胞凋亡情況。重組質(zhì)粒轉染A549細胞后檢測出了目的基因mRNA及蛋白的表達,pGNLY-2A-PFP轉染后細胞死亡率高于其他對照組(P<0.05),死亡細胞以凋亡為主。
　　 結論及研究意義:
　　 1.成功獲取了顆粒溶素和穿孔素基因片段,為顆粒溶素和穿孔素的后續(xù)研究創(chuàng)造了條件。