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1、南京師范大學(xué)碩士學(xué)位論文CIK細(xì)胞毒活性增強(qiáng)的機(jī)理及穿孔素N端肽段放射誘導(dǎo)表達(dá)研究姓名:張蕾申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別:碩士專業(yè):細(xì)胞生物學(xué)指導(dǎo)教師:李芳秋20080529南京師范大學(xué)碩士畢業(yè)論文中文摘要達(dá)測(cè)定及對(duì)K 5 6 2 的殺傷活性測(cè)定。將誘導(dǎo)后的兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較,并分別將健康人和腫瘤病人細(xì)胞誘導(dǎo)前與誘導(dǎo)后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較。.結(jié)果顯示,腫瘤病人P B M C 對(duì)K 5 6 2 細(xì)胞的殺傷活力顯著低于健康人( 尸< 0 .0 5 )
2、 ,而且細(xì)胞毒效應(yīng)分子P F N 、G N L Y 表達(dá)水平也低于健康人;誘導(dǎo)培養(yǎng)后,腫瘤患者和健康人的C I K 對(duì)K 5 6 2 的殺傷活力都比P B M C 有大幅度的提高,且腫瘤病人為顯著提高( 尸< 0 .0 1 ) ;細(xì)胞毒效應(yīng)分子在二組C I K 細(xì)胞中的表達(dá)量發(fā)生分歧:健康人和腫瘤患者C I K 細(xì)胞G N L Y 表達(dá)量都較P B M C 增高,腫瘤患者實(shí)驗(yàn)組增高顯著( P< 0 .0 1 ) ,但P F
3、N 表達(dá)都顯著降低( 尸< 0 .0 5 ) 。 .結(jié)果表明,腫瘤病人C I K 細(xì)胞殺傷活性提高與G N L Y 基因的表達(dá)量升高具有正相關(guān)性。而P F N 基因表達(dá)量卻有所降低,這一現(xiàn)象可能與淋巴細(xì)胞某種自我反饋調(diào)節(jié)途徑相關(guān)。關(guān)鍵詞: C I K 細(xì)胞;穿孔素:顆粒溶素;細(xì)胞毒活性二、人穿孔素N 末端肽段的放射誘導(dǎo)表達(dá)研究早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子l ( e a r l y g r o w t h r e s p o n s e - l
4、 ,E g r - I ) 基因啟動(dòng)子區(qū)含有6 個(gè)高度保守的C C ( A + T ) 6 G G 基序( m o t i f ) ,可在電離輻射產(chǎn)生的氧自由基刺激下誘導(dǎo)下游基因的表達(dá),從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因表達(dá)的時(shí)空調(diào)控。穿孔素( p e r f o r i n ,P F N ) 在腫瘤免疫中發(fā)揮著重要作用,而且第一部分的研究結(jié)果證實(shí)了,很多腫瘤患者的外周血淋巴細(xì)胞中P F N 的表達(dá)量低于健康人,這與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著不可忽略的聯(lián)系。因
5、此,我們擬采用真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)P F N 生物學(xué)活性片段,以期在體外研究P F N 片段蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。我們利用上述E g r o l 啟動(dòng)子的特性,將人穿孔素氨基端片段連接到E g r - 1 啟動(dòng)子下游,構(gòu)建成真核表達(dá)載體,對(duì)其進(jìn)行放射誘導(dǎo)表達(dá)研究。.1 . 構(gòu)建人P F N .N 肽段的真核放射誘導(dǎo)表達(dá)載體。以克隆有h P F N 全長(zhǎng)c D N A序列的載體p c D N A 3 .I ( + ) /h P F N 為
6、模板,設(shè)計(jì)P F N - N 基因的上下游引物,用P C R擴(kuò)增h P F N - N ,經(jīng)N h e I 、K p nI 雙酶切后,將該基因片斷克隆到含放射誘導(dǎo)啟動(dòng)子的真核表達(dá)載體p c D N A 3 .1 ( + ) /E g r q 中,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌J M l 0 9 進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選,并通過(guò)P C R 和雙酶切法鑒定為所需重組質(zhì)粒。2 .P F N - N 端基因在肺癌細(xì)胞S P C .A 1 中的放射誘導(dǎo)表達(dá)。在脂質(zhì)
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