CIK細胞毒活性增強的機理及穿孔素N端肽段放射誘導表達研究.pdf

1、南京師范大學碩士學位論文CIK細胞毒活性增強的機理及穿孔素N端肽段放射誘導表達研究姓名：張蕾申請學位級別：碩士專業(yè)：細胞生物學指導教師：李芳秋20080529南京師范大學碩士畢業(yè)論文中文摘要達測定及對K 5 6 2 的殺傷活性測定。將誘導后的兩組實驗結果進行比較，并分別將健康人和腫瘤病人細胞誘導前與誘導后的實驗結果進行比較。．結果顯示，腫瘤病人P B M C 對K 5 6 2 細胞的殺傷活力顯著低于健康人( 尸< 0 ．0 5 )

2、 ，而且細胞毒效應分子P F N 、G N L Y 表達水平也低于健康人；誘導培養(yǎng)后，腫瘤患者和健康人的C I K 對K 5 6 2 的殺傷活力都比P B M C 有大幅度的提高，且腫瘤病人為顯著提高( 尸< 0 ．0 1 ) ；細胞毒效應分子在二組C I K 細胞中的表達量發(fā)生分歧：健康人和腫瘤患者C I K 細胞G N L Y 表達量都較P B M C 增高，腫瘤患者實驗組增高顯著( P< 0 ．0 1 ) ，但P F

3、N 表達都顯著降低( 尸< 0 ．0 5 ) 。 ．結果表明，腫瘤病人C I K 細胞殺傷活性提高與G N L Y 基因的表達量升高具有正相關性。而P F N 基因表達量卻有所降低，這一現象可能與淋巴細胞某種自我反饋調節(jié)途徑相關。關鍵詞： C I K 細胞；穿孔素：顆粒溶素；細胞毒活性二、人穿孔素N 末端肽段的放射誘導表達研究早期生長反應因子l ( e a r l y g r o w t h r e s p o n s e - l

4、 ，E g r - I ) 基因啟動子區(qū)含有6 個高度保守的C C ( A + T ) 6 G G 基序( m o t i f ) ，可在電離輻射產生的氧自由基刺激下誘導下游基因的表達，從而實現對目的基因表達的時空調控。穿孔素( p e r f o r i n ，P F N ) 在腫瘤免疫中發(fā)揮著重要作用，而且第一部分的研究結果證實了，很多腫瘤患者的外周血淋巴細胞中P F N 的表達量低于健康人，這與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著不可忽略的聯系。因

5、此，我們擬采用真核表達系統表達P F N 生物學活性片段，以期在體外研究P F N 片段蛋白對腫瘤細胞的殺傷作用。我們利用上述E g r o l 啟動子的特性，將人穿孔素氨基端片段連接到E g r - 1 啟動子下游，構建成真核表達載體，對其進行放射誘導表達研究。．1 ． 構建人P F N ．N 肽段的真核放射誘導表達載體。以克隆有h P F N 全長c D N A序列的載體p c D N A 3 ．I ( + ) ／h P F N 為

6、模板，設計P F N - N 基因的上下游引物，用P C R擴增h P F N - N ，經N h e I 、K p nI 雙酶切后，將該基因片斷克隆到含放射誘導啟動子的真核表達載體p c D N A 3 ．1 ( + ) ／E g r q 中，重組質粒轉入大腸桿菌J M l 0 9 進行陽性克隆篩選，并通過P C R 和雙酶切法鑒定為所需重組質粒。2 ．P F N - N 端基因在肺癌細胞S P C ．A 1 中的放射誘導表達。在脂質