表達(dá)高活性干擾素的CIK細(xì)胞對(duì)肝癌的治療作用研究.pdf

1、肝癌惡性程度高，預(yù)后差。我國是肝癌的高發(fā)地，全球每年新發(fā)的肝癌病例中45％在我國大陸。其中一個(gè)重要原因是我國乙肝病毒攜帶者比例高，具有龐大的肝癌高危發(fā)病人群。目前的各種治療手段仍無法從根本上改變肝癌的預(yù)后，亟待研究更為有效的方法用于肝癌的治療。
　　 細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(Cytokine Induced Killer cells，CIK細(xì)胞)是自體外周血單核細(xì)胞在體外經(jīng)多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生的一類免疫殺傷細(xì)胞。CIK細(xì)胞在

2、趨化因子的作用下到達(dá)腫瘤部位，可以直接殺傷或通過抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性效應(yīng)(antibody dependent cell—mediated cytotoxicity，ADCC)來消滅自體或異體來源的敏感腫瘤細(xì)胞，但是單純使用CIK細(xì)胞對(duì)肝癌患者進(jìn)行治療，臨床療效并不顯著。
　　 干擾素是由病毒和其他種類的干擾素誘導(dǎo)劑，刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及體細(xì)胞所產(chǎn)生的一種糖蛋白，主要通過抑制腫瘤病毒的增殖，阻遏癌基因

3、的表達(dá)，阻斷腫瘤細(xì)胞的分裂，調(diào)動(dòng)機(jī)體免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤細(xì)胞以及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的分化發(fā)揮抗腫瘤作用。但是干擾素的臨床應(yīng)用仍存在體內(nèi)半衰期較短；需大劑量頻繁給藥；全身毒副作用強(qiáng)的問題，從而限制了通過提高劑量而提高療效的方法，其臨床應(yīng)用具有很多局限性。
　　 本實(shí)驗(yàn)借助于嵌合型腺病毒Ad5()35作為載體將新型高活性干擾素基因TV1導(dǎo)入到CIK細(xì)胞內(nèi)，然后將CIK細(xì)胞注射到裸鼠體內(nèi)。CIK細(xì)胞可以靶向腫瘤部位，并在腫瘤部位高效、穩(wěn)定表達(dá)干

4、擾素，該方法克服了干擾素治療中由于全身、大劑量和頻繁給藥所帶來的副作用，也克服了單純使用CIK細(xì)胞治療效果不佳的缺陷，充分發(fā)揮了基因治療和免疫細(xì)胞治療兩者的優(yōu)勢，起到了聯(lián)合的抗腫瘤作用。本實(shí)驗(yàn)中所用到的治療基因?yàn)樾滦透呋钚愿蓴_素TV1(IFN—TV1)基因。IFN—TV1是采用基因穿梭法，由12種人干擾素α基因構(gòu)建雜交文庫，采用高通量篩選技術(shù)，篩選10萬個(gè)克隆而得到的高活性新型干擾素，其抗腫瘤作用是目前己上市的國內(nèi)外同類藥物活性的200

5、～400倍；其抗病毒活性是同類藥物的10倍以上。因其具有廣譜抗腫瘤、抗病毒的作用而成為治療肝癌乃至推遲或防止肝硬化的極佳選擇。
　　 同時(shí)基于治療的安全性考慮，本實(shí)驗(yàn)還采用了單純皰疹病毒胸苷激酶基因/丙氧鳥苷(HSV—TK/GCV)自殺基因系統(tǒng)，將HSV—TK基因插入到攜帶有IFN—TV1基因的腺病毒基因組中，當(dāng)干擾素表達(dá)過量時(shí)，向裸鼠體內(nèi)注射更昔洛韋(GCV)殺死表達(dá)干擾素的CIK細(xì)胞，從而降低干擾素表達(dá)，以防止干擾素表達(dá)過量

6、所帶來的副作用，增強(qiáng)治療的安全性。
　　 本實(shí)驗(yàn)主要有以下三部分組成：
　　 一、攜帶IFN—TV1的腺病毒載體的構(gòu)建和制備
　　 將IFN—TV1基因插入到含有CMV啟動(dòng)子的腺病毒載體pDC359中得到腺病毒穿梭載體pDC359—TV1，同時(shí)將TK基因插入到該載體中得到pDC459—TV1，pDC459—TV1與腺病毒骨架載體pAd5F35共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，10天后出現(xiàn)病毒空斑，經(jīng)過3次病毒空斑純化，提取病毒基

7、因組進(jìn)行PCR鑒定，鑒定正確的腺病毒命名為Ad5F35—TV1—TK。經(jīng)293細(xì)胞擴(kuò)增、氯化銫密度梯度離心純化、TCID50測得病毒Ad5F35—TV1—TK滴度為1．5×1010pfu/ml。
　　 二、表達(dá)IFN—TV1的CIK細(xì)胞治療肝癌的體外實(shí)驗(yàn)研究
　　 1、分別用Ad5—EGFP、Ad5F11—EGFP和Ad5F35—EGFP感染CIK細(xì)胞，比較其感染效率，結(jié)果表明與Ad5—EGFP、Ad5F11—EGFP相

8、比，病毒Ad5F35—EGFP對(duì)CIK細(xì)胞感染效率明顯升高，可以達(dá)到90％以上。
　　 2、ELISA方法定量檢測腺病毒Ad5F35—TK—TV1感染CIK細(xì)胞后IFN—TV1的表達(dá)。根據(jù)檢測數(shù)據(jù)可以看出當(dāng)MOI=100時(shí)，2d、4d、6d和8d測得IFN—TV1的表達(dá)量均≥(17．16±4．70)ng達(dá)到并超過了IFN—TV1的有效劑量(IFN—TV1的治療劑量為10pg級(jí))。
　　 3、SRB法檢測所表達(dá)IFN—TV

9、1的生物活性。結(jié)果顯示：當(dāng)IFN—TV1濃度為1ng/ml時(shí)對(duì)肝癌細(xì)胞株7721和Huh7的抑制率分別為(61．01±12．84)％和(60．74±20．06)％，而對(duì)照IFNα—2b濃度為10ng/ml時(shí)，其對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用只有(35．70±11．26)％和(30．37±7．80)％，因此病毒Ad5F35—TV1—TK感染CIK細(xì)胞后所表達(dá)IFN—TV1對(duì)肝癌細(xì)胞株具有較強(qiáng)的抑制作用且明顯強(qiáng)于對(duì)照IFNα—2b。
　　 4

10、、LDH法檢測不同效靶比的CIK細(xì)胞和CIK/Ad5F35—TV1—TK(Ad5F35—TV1—TK感染CIK細(xì)胞后24h)對(duì)肝癌細(xì)胞株7721和Huh7的殺傷作用。結(jié)果顯示：腺病毒Ad5F35—TV1—TK感染CIK細(xì)胞后，CIK/Ad5F35—TV1—TK對(duì)肝癌細(xì)胞株的殺傷活性顯著增強(qiáng)比單純使用CIK細(xì)胞增強(qiáng)了20％以上，說明病毒感染CIK細(xì)胞后并未降低CIK細(xì)胞的抗腫瘤活性，反而發(fā)揮了聯(lián)合的抗腫瘤效應(yīng)。
　　 5、定量PC

11、R檢測TK基因表達(dá)。結(jié)果顯示：Ad5F35—TV1—TK與Ad5F35—TV1和空白對(duì)照相比，TK基因能夠有效表達(dá)。
　　 三、表達(dá)IFN—TV1的CIK細(xì)胞治療肝癌的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究
　　 1、ELISA方法檢測腺病毒Ad5F35—TV1—TK分別感染常氧和低氧條件下培養(yǎng)的CIK細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注射到裸鼠體內(nèi)后1FN—TV1的表達(dá)量。當(dāng)MOI=100時(shí)，7d、10d、14d和21d檢測常氧條件下培養(yǎng)的CIK細(xì)胞TN1的表達(dá)量普

12、遍高于低氧條件下培養(yǎng)的CIK細(xì)胞，且其表達(dá)量高于治療的有效劑量，達(dá)到(248．63±53．90)pg/ml。
　　 2、CIK細(xì)胞基因治療系統(tǒng)對(duì)裸鼠移植瘤的抑制作用，CIK/Ad5F35—TV1—TK治療組療效明顯優(yōu)于PBS對(duì)照組，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0．013)。
　　 3、CIK細(xì)胞基因治療系統(tǒng)對(duì)荷瘤裸鼠生存期的影響。PBS對(duì)照組在治療開始后第28天開始死亡，86天全部死亡。直至對(duì)照組小鼠全部死亡時(shí)，CIK/Ad

13、5F35—TV1—TK系統(tǒng)治療組裸鼠全部存活。
　　 結(jié)論：本課題成功構(gòu)建了同時(shí)攜帶新型高活性IFN—TV1和HSV—TK基因的嵌合型腺病毒Ad5F35—TV1—TK，該病毒能高效感染CIK細(xì)胞，從而將治療基因?qū)隒IK細(xì)胞內(nèi)，在體內(nèi)高效、穩(wěn)定表達(dá)IFN—TV1。CIK/Ad5F35—TV1—TK治療系統(tǒng)能顯著抑制裸鼠移植瘤和延長荷瘤裸鼠生存期。該方案綜合了腫瘤的基因治療和細(xì)胞治療的雙重優(yōu)勢，彌補(bǔ)了單純細(xì)胞治療效果差的不足，也克