MiR-221增強(qiáng)干擾素抗HCV作用及atRA對(duì)肝癌細(xì)胞的血清饑餓保護(hù)作用研究.pdf

1、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是導(dǎo)致輸血后肝炎的主要病原體之一，其流行呈全球性分布，全世界有1.7～2億人感染HCV。HCV導(dǎo)致的丙型肝炎易慢性化，慢性率高達(dá)70％，且與肝硬化以及肝細(xì)胞癌高度相關(guān)。目前HCV的治療方法主要是干擾素-α(interferon-α，IFN-α)聯(lián)合利巴韋林，但是療效并不理想，且治療昂貴、副作用大。肝癌是全球第五大流行的腫瘤，全球每年有超過50萬新患者。HCV感染是誘發(fā)肝細(xì)胞癌的重

2、要因素之一，具體的誘發(fā)機(jī)制尚未完全清楚。據(jù)報(bào)道，HCV基因組編碼的多個(gè)蛋白如核心蛋白core、非結(jié)構(gòu)蛋白NS5A等與肝癌發(fā)生有關(guān)。目前，對(duì)肝癌的治療仍以手術(shù)切除為首選，同時(shí)輔以化學(xué)治療或者藥物治療。
　　 MicroRNAs(miRNAs)是一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，主要生物學(xué)功能是通過與其靶標(biāo)分子的3'-UTRs結(jié)合來抑制翻譯或降解mRNA來調(diào)控基因表達(dá)。miRNAs參與各種細(xì)胞發(fā)育、增殖、分化、凋亡等，并參與肝癌癥等多種

3、疾病的發(fā)生發(fā)展。研究表明，miRNAs作為一類新的分子靶標(biāo)，應(yīng)用于腫瘤的診斷、治療及預(yù)后判斷等。同時(shí)，由于肝癌的治療效果局限，誘導(dǎo)分化作為一個(gè)新型而有效的腫瘤治療方法用于肝癌的治療，誘導(dǎo)分化劑也因此越來越受到關(guān)注。全反式維甲酸（all-trans retinoic acid，atRA）是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最重要的一類誘導(dǎo)分化劑，已成功應(yīng)用于治療急性早幼粒細(xì)胞性白血病（acute promyelocytic leukemia，APL），但有研

4、究表明atRA在一定條件下可以保護(hù)癌細(xì)胞。本文就miR-221對(duì)HCV的調(diào)控以及atRA保護(hù)肝癌細(xì)胞生存的作用機(jī)制進(jìn)行了研究。
　　 一、MiR-221作用于SOCS1/SOCS3增強(qiáng)IFN抗HCV作用
　　 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷更新，研究人員采用RNA干擾、生物芯片等方式對(duì)HCV生命周期進(jìn)行了深入研究，確定了與病毒入侵相關(guān)的四個(gè)受體分子(CD81、SR-BI、Claudin-1和Occludin)，并發(fā)現(xiàn)了具有調(diào)節(jié)

5、病毒復(fù)制作用的磷脂酰肌醇4激酶和作用于病毒包裝釋放過程中的脂蛋白等。最近研究發(fā)現(xiàn)microRNAs在病毒的生命周期中扮演者重要的角色。例如miR-122通過與HCV5’-UTR結(jié)合促進(jìn)病毒的復(fù)制，miR-193b調(diào)節(jié)HCV對(duì)Sorafenib藥物的敏感性等等。
　　 miR-221廣泛表達(dá)在各種組織細(xì)胞中，其編碼基因位于X染色體上，通過作用于CDKN1C/p57、CDKN1B/p27、Bmf等分子促進(jìn)肝細(xì)胞癌的發(fā)生。本研究首先檢

6、測(cè)到HCV感染的細(xì)胞上清以及病人血清中的miR-221水平升高。在Huh-7.5.1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-221的mimics與inhibitor后再以HCVcc(HCV cell culture-derived virus)感染，通過FQ-PCR和免疫熒光檢測(cè)其對(duì)HCV感染性的影響。結(jié)果顯示miR-221過表達(dá)或抑制對(duì)HCV的復(fù)制卻沒有影響。在Huh-7.5.1中加入IFN-α后，可以觀察到miR-221顯著增強(qiáng)干擾素的抗HCV作用。故推

7、測(cè)miR-221抑制HCV的復(fù)制與干擾素相關(guān)。將miR-221 mimics與inhibitor轉(zhuǎn)染Huh-7.5.1細(xì)胞后以HCVcc感染，發(fā)現(xiàn)HCV感染可以促進(jìn)IFN-α的表達(dá)，但卻不受miR-221水平的影響。繼而，通過western blot的方法檢測(cè)miR-221對(duì)IFN-α/JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響，過表達(dá)miR-221后，JAK1、STAT1與STAT3分子的磷酸化水平上升，inhibitor則有相反的作用。通過

8、Targetscan與PicTar在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)沒有發(fā)現(xiàn)JAK/STAT通路中的成員與miR-221有直接的相互作用，但發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子(suppressorsof cytokine signaling，SOCS)家族的SOCS1、SOCS3兩個(gè)分子的3'-UTR存在miR-221的結(jié)合位點(diǎn)。為了證實(shí)上述預(yù)測(cè)，我們構(gòu)建了表達(dá)熒光素酶報(bào)告基因的SOCS1和SOCS3野生型和突變型（miR-221不能與SOCS1、SOCS3發(fā)生

9、相互作用）表達(dá)載體，與miR-221 mimics共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，檢測(cè)熒光素酶活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SOCS1和SOCS3是miR-221的靶標(biāo)分子。為了確認(rèn)miR-221是通過SOCS抑制HCV的復(fù)制，我們隨后構(gòu)建了SiSOCS1、SiSOCS3小干擾RNA來分別干擾SOCS1、SOCS3的表達(dá)。結(jié)果表明下調(diào)SOCS后，JAK/STAT的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)，即JAK1、STAT1、STAT3的磷酸化水平升高，隨即HCV的復(fù)制水平下降

10、，干擾素的抗HCV作用增強(qiáng)。上述研究結(jié)果表明，SOCS家族是JAK/STAT通路的主要負(fù)調(diào)控因子，miR-221作用于SOCS后抑制其表達(dá)，繼而減弱了SOCS對(duì)IFN/JAK/STAT的負(fù)調(diào)控作用，故推測(cè)miR-221是通過抑制SOCS1、SOCS3的表達(dá)而促進(jìn)JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)而抑制HCV的復(fù)制。
　　 病毒入侵宿主細(xì)胞并建立完整的感染周期是一個(gè)復(fù)雜的過程，不僅有宿主的抗病毒免疫應(yīng)答，同時(shí)病毒也通過逃逸而復(fù)制播散，該過

11、程是病毒與宿主相互博弈的過程。miR-221在HCV感染與復(fù)制中也發(fā)揮著不同的作用，一方面可以維持HCV基因組的穩(wěn)定性并促進(jìn)其復(fù)制，另一方面還可以通過作用于SOCS1/SOCS3增強(qiáng)IFN的抗HCV作用。基于病毒與宿主相互作用的復(fù)雜性，miR-221在HCV復(fù)制和感染中的作用有待進(jìn)一步研究。
　　 二、全反式維甲酸保護(hù)肝癌細(xì)胞抵御血清饑餓作用
　　 維甲酸(RA)又稱為視黃酸，是由維生素A在體內(nèi)氧化成視黃醛，再進(jìn)一步氧化

12、而成。維甲酸可調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化與成熟，是維持機(jī)體正常生長(zhǎng)發(fā)育和各種生理活動(dòng)必不可少的重要因素。維甲酸發(fā)揮生物活性主要是通過與細(xì)胞內(nèi)的維甲酸受體RAR(retinoid-x receptor)結(jié)合，形成異二聚體結(jié)合到DNA上調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)。atRA（全反式維甲酸）是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最重要的一類誘導(dǎo)分化劑。atRA用于肝細(xì)胞癌的治療基于以下三個(gè)方面的作用:1.誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡;2.抑制腫瘤細(xì)胞增殖;3.誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞分化。
　　

13、atRA用于肝細(xì)胞癌的治療時(shí)因條件變化而具有不同表現(xiàn)，正常的條件下具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)分化促進(jìn)凋亡的效果，但在血清饑餓的時(shí)候，atRA卻保護(hù)肝癌細(xì)胞，表現(xiàn)為相反的效果。本研究對(duì)atRA保護(hù)肝癌細(xì)胞抵抗血清饑餓的可能機(jī)制進(jìn)行了研究。我們對(duì)三種肝癌細(xì)胞系（HepG2、HepG3B和Huh7細(xì)胞）進(jìn)行無血清、無血清和atRA共培養(yǎng)，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)。結(jié)果表明HepG2細(xì)胞在血清饑餓36小時(shí)后開始凋亡，48小時(shí)后細(xì)胞凋亡超過50％，96小時(shí)

14、后細(xì)胞幾乎全部死亡;但經(jīng)10μM atRA處理后的HepG2細(xì)胞在血清饑餓下到60小時(shí)才開始凋亡，120小時(shí)后細(xì)胞還保持有30％存活，168小時(shí)后細(xì)胞才全部死亡。在Hep3B和Huh-7細(xì)胞中得到類似的結(jié)果。這說明atRA在無血清條件下具有保護(hù)肝癌細(xì)胞的作用，且這種保護(hù)作用具有劑量依賴性。為了探索atRA的保護(hù)機(jī)制，我們用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)對(duì)照組以及實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡:atRA處理的細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞在細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡上沒有顯著差別。

15、我們?cè)谂囵B(yǎng)細(xì)胞時(shí)意外發(fā)現(xiàn)atRA處理組細(xì)胞較對(duì)照組細(xì)胞貼壁早，進(jìn)一步設(shè)置不同檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)atRA處理可以明顯增強(qiáng)細(xì)胞的粘附作用。細(xì)胞的粘附能力一般是受細(xì)胞外基質(zhì)分子影響的，用Illumina HumanHT-12 v4芯片檢測(cè)atRA處理組與對(duì)照組的基因表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn):有380個(gè)基因表達(dá)差異，其中207個(gè)上調(diào)，173個(gè)下調(diào)。上調(diào)倍數(shù)最高的基因是CYP26A1、HINT3、miR-1282、CYP26B1。對(duì)基因差異進(jìn)行功能分析發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞

16、外基質(zhì)相關(guān)的基因主要分布在上調(diào)區(qū)，其中變異較大的是COL8A2(collagen8A2)分子。通過RT-PCR與Western blot進(jìn)一步確認(rèn)了該結(jié)果。這提示COL8A2可能參與到了atRA對(duì)肝癌細(xì)胞的血清饑餓保護(hù)作用。為了確認(rèn)該推測(cè)，隨后用siRNA下調(diào)COL8A2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)atRA對(duì)COL8A2下調(diào)的肝癌細(xì)胞的血清饑餓保護(hù)作用也消失了，同時(shí)對(duì)細(xì)胞的粘附增強(qiáng)作用也消失了。進(jìn)一步研究表明，COL8A2除了具有增強(qiáng)細(xì)胞粘附的能力之外

17、，還具有增強(qiáng)肝癌細(xì)胞遷移與侵入的能力:COL8A2過表達(dá)后，肝癌細(xì)胞的遷徙率和侵染率分別增加了31.6％和77.8％，而干擾COL8A2的表達(dá)，細(xì)胞遷徙率和侵染率分別降低了32.2％和59.6％。綜上所述，血清饑餓的條件下atRA能保護(hù)肝癌細(xì)胞免受凋亡作用，該作用是通過上調(diào)COL8A2表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。
　　 腫瘤的誘導(dǎo)分化治療是一個(gè)新穎的治療方法，目前對(duì)其研究還處在初步的階段，還存在很多的未知領(lǐng)域。有效的誘導(dǎo)分化劑是該方案的關(guān)鍵，

18、atRA是目前發(fā)現(xiàn)的最有效誘導(dǎo)分化劑，但也有一些負(fù)作用的報(bào)道。我們的研究進(jìn)一步豐富了atRA在抗肝癌治療中的不同角色，為其用于臨床治療肝癌提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。
　　 小結(jié):
　　 1.MiR-221能夠抑制體外細(xì)胞模型中HCV的復(fù)制，該作用是通過抑制SOCS1/SOCS3的表達(dá)，減弱其對(duì)IFN/JAK/STAT的負(fù)調(diào)控作用，從而促進(jìn)了JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，增強(qiáng)了干擾素的抗病毒效果而實(shí)現(xiàn)的。
　　 2.全反式維甲