瘦素促進人肝癌細胞增殖、侵襲和抗凋亡作用及其作用機制的初步研究.pdf

1、背景與目的：
　　 最近的流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)肥胖與原發(fā)性肝細胞性肝癌的關(guān)系密切，而肥胖人群體內(nèi)血清的瘦素水平增高，作為一種調(diào)節(jié)能量代謝的脂肪因子，瘦素也有生長因子的作用，但其與肝癌的關(guān)系報道不多。本研究擬首先觀察瘦素及其受體在原發(fā)性肝細胞性肝癌組織中的表達情況，接著觀察瘦素對人肝癌細胞增殖、凋亡和侵襲的影響并初步探討其可能的機制，為瘦素可能作為一種重要的生長因子參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　

2、 (1)瘦素及其受體在人肝癌組織中表達情況的研究：采用免疫組織化學(xué)染色法檢測28例原發(fā)性肝細胞性肝癌及其對應(yīng)的癌旁組織中瘦素和瘦素受體蛋白的表達,并就其表達與臨床病理組織學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系進行分析。
　　 (2)瘦素對人肝癌細胞增殖活性的研究：以人肝癌細胞Huh 7為研究對象，在培養(yǎng)液中加入不同濃度的瘦素后，采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測細胞增殖，流式細胞儀檢測細胞周期，實時熒光定量PCR和Western blot 法檢測細胞

3、周期調(diào)控蛋白CyclinD1和P21 waf1的表達。
　　 (3)瘦素對阿霉素誘導(dǎo)人肝癌細胞凋亡的影響：用阿霉素作為凋亡誘導(dǎo)劑預(yù)處理Huh 7 細胞3h 后，在培養(yǎng)液中加入濃度為100ng/ml的瘦素，24h 后提取細胞DNA電泳檢測DNA ladder，Hochest33258 熒光染色觀察細胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化，流式細胞儀檢測細胞的凋亡率，實時熒光定量PCR檢測凋亡相關(guān)基因Bax和Bcl-2的表達情況。
　　 (4)

4、瘦素對人肝癌細胞體外侵襲、遷移能力的影響：用細胞劃痕遷移實驗和細胞侵襲重建基底膜實驗觀察測瘦素(100 ng/ml)作用24 h 后對Huh 7 細胞遷移力和侵襲力的影響，并用實時熒光定量PCR分析瘦素對基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinase，MMP)mRNA的影響。
　　 結(jié)果：
　　 (1)瘦素在肝癌組織和癌旁組織中的陽性率分別為82.14[％]和35.71[％]，瘦素受體在肝癌組織和癌旁組織

5、中的陽性率分別為78.57[％]和42.68[％]，瘦素及其受體在肝癌組織中的陽性率都高于癌旁組織，差別具有顯著性差異(P<0.01)。瘦素及其受體的表達與患者年齡、性別、HbsAg 陽性、抗-HCV 抗體陽性、伴有肝硬化與否、腫瘤大小、腫瘤分期和組織學(xué)分級均無相關(guān)性，其差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),但瘦素及其受體的高低表達與腫瘤是否發(fā)生血管侵犯有關(guān)，發(fā)生血管侵犯的腫瘤的瘦素及其受體的表達率均高于未發(fā)生血管侵犯的腫瘤，其差別具有統(tǒng)計

6、學(xué)意義(P<0.05)。
　　 (2)通過生長曲線可以發(fā)現(xiàn)，處理組的細胞數(shù)明顯高于對照組，而且隨著瘦素濃度的增加，細胞數(shù)也增加，有一定的劑量依耐性；MTT 法檢測細胞增殖顯示瘦素可以促進Huh 7 細胞的增殖，有一定的時間和劑量依耐性；流式細胞儀檢測結(jié)果顯示瘦素能明顯降低G0/G1 期細胞比例并提高S 期細胞比例，細胞凋亡率也有明顯降低；
　　 實時熒光定量PCR和Western blot 法檢測顯示瘦素(100ng/m

7、l)處理24h 后，CyclinD1mRNA和蛋白的表達明顯增高，P21 waf1 mRNA和蛋白的表達明顯降低，其差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
　　 (3)瘦素能夠抑制阿霉素誘導(dǎo)的人肝癌細胞凋亡，與對照組相比，瘦素處理組的DNA ladder 條帶明顯減弱，Hochest33258 熒光染色也發(fā)現(xiàn)瘦素處理組的凋亡細胞明顯減少，流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)對照組的凋亡率是(47.77±2.90)[％]，而瘦素處理組的凋亡率是(30

8、.17±2.03)[％]，明顯下降(P<0.01)，實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)Bcl-2 mRNA表達量增高至對照組的2.31 倍，Bax mRNA 表達量減弱至對照組的0.46 倍，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 (4)瘦素(100ng/ml)處理24h 后，與對照組細胞相比，瘦素處理組的細胞遷移運動能力明顯增強，細胞穿透聚碳酸酯膜的能力也顯著增強(41.80±3.19 對18.20±2.86，P<0.01)；實時

9、熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)MMP-2和MMP-9 mRNA 表達量分別增高至對照組的4.25和2.73 倍(P 均<0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 本研究發(fā)現(xiàn)瘦素及其受體在肝癌組織中存在著高表達現(xiàn)象，發(fā)生血管侵犯的腫瘤的瘦素及其受體的表達率均高于未發(fā)生血管侵犯的腫瘤；用外源性瘦素直接干預(yù)人肝癌細胞系Huh 7 細胞，能明顯影響腫瘤細胞周期，促進腫瘤細胞的增殖，其機制可能是通過促進Cyclin D1 表達、抑制P21 waf