新城疫病毒V蛋白的表達(dá)及其對(duì)干擾素活性影響的研究.pdf

1、新城疫病毒(Newcastlediseasevirus，NDV)可以在雞群中引發(fā)以呼吸道、神經(jīng)系統(tǒng)或是腸道病變?yōu)橹饕Y狀，具有高度傳染性的疾病。由于危害嚴(yán)重，其致病和免疫機(jī)理一直是研究的熱點(diǎn)。干擾素(IFN)系統(tǒng)是宿主抵抗病毒感染的第一道防線，近年來(lái)的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)副粘病毒通過(guò)RNA編輯作用產(chǎn)生的V蛋白具有阻斷IFN抗病毒活性的功能，因而和病毒的致病性有著密切關(guān)系。NDV屬于副粘病毒科禽腮腺炎(Avulavirus)病毒屬，其基因組編碼六

2、種主要結(jié)構(gòu)蛋白，其中P基因可以通過(guò)“RNA編輯”的方式編碼產(chǎn)生額外的兩個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白-V蛋白和W蛋白。NDV的V蛋白與其他副粘病毒的V蛋白一樣具有相似的特殊結(jié)構(gòu)，可能與NDV毒力有密切關(guān)系。 為了深入研究NDVV蛋白的功能及其與病毒致病性的關(guān)系，我們通過(guò)RT-PCR方法分別獲得雞、鴿和鵝源NDVV蛋白的cDNA，然后分別通過(guò)原核表達(dá)的重組V蛋白和真核表達(dá)載體，在體內(nèi)外研究了V蛋白對(duì)NDV誘生IFN活性的影響，比較了不同宿主V蛋白功

3、能的差異。 本試驗(yàn)根據(jù)NDVP基因序列分別設(shè)計(jì)合成三條特異性引物，V1和V3用于基因擴(kuò)增，V2是用來(lái)插入G的突變引物。采用RT-PCR方法分別從雞、鴿、鵝源NDV尿囊液中擴(kuò)增、克隆出NDV部分P基因cDNA，以cDNA為模板，V1和V2為引物PCR擴(kuò)增V基因的前半段序列并引入了相應(yīng)的突變。然后以該產(chǎn)物為引物和V3一起通過(guò)PCR方法分別獲得雞、鴿和鵝源NDVV基因全長(zhǎng)cDNA并將其克隆到pMD18-T載體上，篩選到的雞、鴿、鵝源N

4、DVV基因陽(yáng)性重組質(zhì)粒分別命名為pMD18-T-c-V、pMD18-T-p-V和pMD18-T-g-V。對(duì)我們獲得的cDNA我們進(jìn)行了核苷酸序列測(cè)定。通過(guò)和GenBank中發(fā)表的其它副粘病毒V基因序列同源性比較結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)：NDVV蛋白的羧基端同樣含有七個(gè)半胱氨酸殘基，分別位于第196、200、212、214、217、221和224位，這七個(gè)C所形成的結(jié)構(gòu)可以結(jié)合兩個(gè)Zn2+離子，形成典型的C2H2或C3H4型鋅指基序，這種結(jié)構(gòu)在所有副

5、粘病毒科的成員中存在，可能與病毒的抗干擾素活性和病毒毒力有關(guān)。從進(jìn)化樹(shù)上可以看到：利用V蛋白進(jìn)行NDV遺傳演化分析所得的結(jié)果和通過(guò)NDVF基因進(jìn)行分析的結(jié)果相一致，提示NDVV基因和其它基因一樣在不斷地的演化當(dāng)中，并且可能NDV的毒力強(qiáng)弱有一定的相關(guān)性。同樣副粘病毒的V蛋白可能是決定副粘病毒分類(lèi)地位重要依據(jù)之一。本研究中雞、鴿、鵝源NDVV基因的核苷酸和氨基酸與LaSota、Clone30、Hert33、QueenslandV4、ZJ1

6、等NDV分離株相應(yīng)的序列的同源性比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)：相同宿主來(lái)源的毒株無(wú)論在核苷酸還是在氨基酸水平上的同源性都很高，這一點(diǎn)在鵝源和鴿源上體現(xiàn)的比較充分，但是雞源在核苷酸和氨基酸上的同源性相對(duì)較低，核苷酸多集中在80-85％之間，而氨基酸則多集中在75-80％之間。鴿源和鵝源在V蛋白上均具有特殊的氨基酸殘基，這些氨基酸的點(diǎn)突變能否對(duì)影響到所在基因的功能?是否具有宿主特異性?有待進(jìn)一步的研究來(lái)解釋。 由于V蛋白是非結(jié)構(gòu)蛋白且表達(dá)量不是很高

7、，很難從病毒感染細(xì)胞中提取。也正是這一原因，導(dǎo)致對(duì)其功能研究的相對(duì)滯后。為了從根本上解決研究V蛋白功能的這一瓶頸問(wèn)題我們將雞源NDVF48E9的V基因cDNA構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET-30c上，構(gòu)建成F48E9株NDVV蛋白的高效原核表達(dá)系統(tǒng)。該表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組V蛋白以包涵體的形式存在，分子量大小為28KD左右。我們采用8mol/L脲變性，Ni-NTA柱吸附純化了重組蛋白，經(jīng)透析復(fù)性，得到純化的可溶性NDVV蛋白，純化率達(dá)到35％。將復(fù)

8、性后的NDVV蛋白免疫21日齡SPF雞(300μg/只)，成功制備出NDVV蛋白的抗血清。在Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)F48E9株NDV抗血清可以和重組V蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，但反應(yīng)的特異性和靈敏度不如我們制備的重組V蛋白特異性血清。這可能是由于在病毒復(fù)制過(guò)程中V蛋白的表達(dá)水平較高，V蛋白很可能以某種形式與病毒粒子結(jié)合而成為免疫原造成的，另外，P蛋白和V蛋白N末端的同源序列所一起的交叉反應(yīng)也可能是原因之一。 為了在細(xì)胞中和雞體

9、內(nèi)研究V蛋白的功能，我們構(gòu)建了三種宿主NDVV蛋白的真核表達(dá)載體和瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，Westernblot檢測(cè)證實(shí)三種宿主來(lái)源的NDVV蛋白真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后都能正確表達(dá)相應(yīng)的重組V蛋白，利用該系統(tǒng)我們分別在體內(nèi)外對(duì)V蛋白拮抗IFN活性的作用及其是否存在宿主的特異性進(jìn)行了初步研究。 應(yīng)用MTT法體外檢測(cè)NDVV重組蛋白拮抗IFN活性發(fā)現(xiàn)：1.在接種NDV后，表達(dá)V蛋白的細(xì)胞中IFN活性水平低于沒(méi)有表達(dá)V蛋白的細(xì)胞。說(shuō)明NDVV蛋

10、白對(duì)IFN的具有一定的拮抗作用。2.所有表達(dá)NDVV蛋白的細(xì)胞在接種LaSota或F48E9后，前者所誘導(dǎo)產(chǎn)生的IFN水平明顯高于后者的，說(shuō)明不同毒力的NDV分離株接種細(xì)胞后產(chǎn)生IFN活性的拮抗作用的效果是不同的。3.表達(dá)雞源的重組V蛋白的細(xì)胞中，由NDVLaSota或F48E9誘導(dǎo)產(chǎn)生的IFN水平與表達(dá)鴿源或鵝源NDVV蛋白的細(xì)胞中產(chǎn)生的IFN水平之間存在顯著差異，然而表達(dá)鴿源和鵝源NDVV蛋白的細(xì)胞所產(chǎn)生的IFN活性則沒(méi)有顯著差異。

11、可能是由于鴿源和鵝源分離株在V蛋白上的點(diǎn)突變和C端的CTDs區(qū)域與雞源的同源性高低有關(guān)。盡管鵝源和鴿源分離株之間在整個(gè)V蛋白氨基酸水平上存在一定差異，但它們整體的同源性很高，可達(dá)80.4％，尤其是V蛋白C末端181位以后的氨基酸同源性更高達(dá)96.6％，因此它們的V蛋白所發(fā)揮的效應(yīng)可能相差不多，刺激細(xì)胞產(chǎn)生IFN活性也就很接近了。這一個(gè)結(jié)果表明NDVV蛋白拮抗IFN活性的能力可能存在著宿主差異。 在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，我們將純化的F48E

12、9株NDVV蛋白、pCI-neo-c-V和LaSota活苗進(jìn)行不同組合分別免疫21日齡SPF雞(300μg/只)，二免21天后接種NDVF48E9強(qiáng)毒，攻毒后采集血液樣本，檢測(cè)血清中的IFN活性，觀察雞的死亡率。結(jié)果表明，F(xiàn)48E9株NDVV蛋白和pCI-neo-c-V聯(lián)合免疫實(shí)驗(yàn)組機(jī)體血清中的IFN活性最低，單獨(dú)免疫提純的pCI-neo-c-V質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)組機(jī)體血清中的IFN與對(duì)照組相近。各免疫組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清中IFN水平的變化趨勢(shì)是高到低

13、依次為L(zhǎng)＞L+P＞(L+Pr)+(L+P)＞(L+P)+(L+Pr)＞L+Pr＞L+P+Pr。在免疫物不同的情況下，導(dǎo)致血清中IFN活性降低的程度是不一樣的。純化的V蛋白在免疫反應(yīng)中起到了主導(dǎo)性的作用，質(zhì)粒在免疫反應(yīng)中的作用不是很大，但仍以質(zhì)粒和蛋白聯(lián)合免疫的實(shí)驗(yàn)組IFN活性最低，與兩次免疫物都為L(zhǎng)+Pr的實(shí)驗(yàn)組還是有一定程度的區(qū)別?？偟膩?lái)說(shuō)，純化的V蛋白在影響免疫反應(yīng)上起著主導(dǎo)性的作用，說(shuō)明機(jī)體內(nèi)是由V蛋白來(lái)拮抗IFN介導(dǎo)的抗病毒體系

14、的，這與體外檢測(cè)的結(jié)果是一致的。各實(shí)驗(yàn)組的死亡率分析發(fā)現(xiàn)，P+Pr實(shí)驗(yàn)組最先出現(xiàn)死亡，其次是免疫Pr的實(shí)驗(yàn)組，緊跟著的是單純免疫質(zhì)粒P和水對(duì)照實(shí)驗(yàn)組，而LaSota單獨(dú)免疫組沒(méi)有發(fā)病和死亡。這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了NDVV蛋白在雞體內(nèi)發(fā)揮了IFN拮抗物的作用，破壞了動(dòng)物體內(nèi)由IFN介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答。 綜上所述，NDVV蛋白具有拮抗IFN活性的作用，并且這種作用已足以影響疫苗免疫對(duì)強(qiáng)毒株攻擊的保護(hù)水平，說(shuō)明V蛋白和NDV毒力有一定