NK細(xì)胞通過clathrin途徑回收穿孔素及對(duì)殺傷功能的影響.pdf

1、一、前言
　　 自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK cell）是固有免疫系統(tǒng)的重要組分，其通過釋放胞毒效應(yīng)分子（穿孔素、顆粒酶等）而殺傷畸變的自身細(xì)胞及感染病原體的靶細(xì)胞。NK細(xì)胞無需致敏即能直接殺傷靶細(xì)胞，并可連續(xù)殺傷多個(gè)靶細(xì)胞。
　　 目前尚不清楚，NK細(xì)胞每次殺傷過程中所釋放胞毒效應(yīng)分子的量，及其連續(xù)殺傷過程中通過何種機(jī)制不斷補(bǔ)充自身“彈藥庫”以維持“戰(zhàn)斗力”。理論上，NK細(xì)胞可不斷合成新的

2、效應(yīng)分子，但該過程涉及效應(yīng)分子的糖基化修飾、剪切、構(gòu)象改變，最后進(jìn)入分泌性溶酶體，全程需數(shù)小時(shí)。因此，探討NK細(xì)胞持續(xù)性殺傷過程中合成和儲(chǔ)備胞毒效應(yīng)分子的確切機(jī)制，有助于從新的角度闡明NK細(xì)胞殺傷功能的機(jī)制。
　　 免疫突觸與神經(jīng)突觸有諸多相似之處。文獻(xiàn)報(bào)道，神經(jīng)突觸胞吐后可發(fā)生有效的補(bǔ)償性內(nèi)吞，此對(duì)于維持突觸功能具有重要意義。神經(jīng)突觸內(nèi)分泌性囊泡與細(xì)胞膜融合后，包括膜蛋白的多種分子可迅速回收至神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)，其生物學(xué)意義為：減少胞

3、吐所致細(xì)胞膜表面積增大；回收的膜蛋白可參與形成新的分泌囊泡，從而有利于神經(jīng)突觸適應(yīng)不斷發(fā)放的神經(jīng)沖動(dòng)。除膜蛋白外，神經(jīng)細(xì)胞還可回收可溶性神經(jīng)遞質(zhì)。近年文獻(xiàn)（包括本課題組前期研究）報(bào)道，免疫突觸中存在雙向運(yùn)輸?shù)妮d體，也具有回收存儲(chǔ)胞毒效應(yīng)分子的分泌性溶酶體膜蛋白的能力。深入探討胞毒效應(yīng)分子的回收作用，有助于揭示細(xì)胞毒性T細(xì)胞（cytotoxic Tlymphocyte，CTL）和NK細(xì)胞持續(xù)性殺傷作用的機(jī)制。穿孔素是一類重要的胞毒效應(yīng)分子

4、，在NK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用，本文擬在課題組前期研究基礎(chǔ)上，探討NK細(xì)胞回收穿孔素的作用，并闡明其機(jī)制及生物學(xué)意義。
　　 二、NK92細(xì)胞受靶細(xì)胞刺激后可繼發(fā)性內(nèi)吞釋放的穿孔素
　　 早期內(nèi)體是細(xì)胞回收細(xì)胞外物質(zhì)的最初細(xì)胞器，早期內(nèi)體體積增大提示外源性物質(zhì)的進(jìn)入。本實(shí)驗(yàn)用熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)鐵蛋白作為示蹤分子，觀察其被NK92細(xì)胞內(nèi)吞后的定位。轉(zhuǎn)鐵蛋白內(nèi)吞后進(jìn)入早期內(nèi)體，導(dǎo)致后者體積顯著增大，可作為細(xì)胞發(fā)生內(nèi)吞的指

5、標(biāo)。此外，與早期內(nèi)體共定位也表明內(nèi)吞的分子已進(jìn)入早期內(nèi)體。
　　 通過觀察NK92細(xì)胞早期內(nèi)體，判斷NK92細(xì)胞被靶細(xì)胞刺激后是否發(fā)生胞吞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：NK92細(xì)胞受靶細(xì)胞刺激15分鐘后，其早期內(nèi)體比對(duì)照組明顯增大，提示NK92細(xì)胞發(fā)生內(nèi)吞。
　　 乙二醇四醋酸[Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraaceticacid，EGTA]可抑制NK92細(xì)胞胞吐

6、，但并不影響NK92細(xì)胞與靶細(xì)胞間形成免疫突觸。為探討內(nèi)吞發(fā)生的時(shí)相，我們?cè)贜K92細(xì)胞與靶細(xì)胞接觸過程中加入EGTA，發(fā)現(xiàn)可顯著抑制早期內(nèi)體增大。提示NK細(xì)胞內(nèi)吞繼發(fā)性于胞吐之后。
　　 我們還發(fā)現(xiàn)，靶細(xì)胞刺激NK92細(xì)胞15分鐘，穿孔素與早期內(nèi)體出現(xiàn)明顯共定位現(xiàn)象，而未受刺激的NK92細(xì)胞無此現(xiàn)象。另外，加入EGTA 同樣可抑制穿孔素與早期內(nèi)體共定位。上述結(jié)果表明，NK92細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞過程中出現(xiàn)穿孔素內(nèi)吞，該效應(yīng)繼發(fā)于胞吐

7、。
　　 三、NK92細(xì)胞通過clathrin 途徑回收穿孔素
　　 首先應(yīng)用放線菌酮抑制新蛋白質(zhì)合成，以避免新生成的穿孔素干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。繼而應(yīng)用針對(duì)不同胞吞途徑的抑制劑，探討NK92細(xì)胞內(nèi)吞作用的機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：應(yīng)用針對(duì)clathrin 途徑的抑制劑后，受靶細(xì)胞刺激的NK92細(xì)胞內(nèi)其穿孔素水平明顯降低（與未用抑制劑的NK92細(xì)胞相比）；應(yīng)用針對(duì)脂筏和胞飲途徑的抑制劑并不影響胞內(nèi)穿孔素水平。提示：穿孔素內(nèi)吞效應(yīng)為clat

8、hrin 途徑依賴性，脂筏和胞飲途徑介導(dǎo)的內(nèi)吞不參與穿孔素回收。
　　 借助共聚焦顯微鏡進(jìn)一步證實(shí)穿孔素循clathrin 內(nèi)吞途徑被回收，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：
　　 在針對(duì)clathrin 內(nèi)吞途徑的化學(xué)抑制劑作用下，NK92細(xì)胞受靶細(xì)胞刺激后，穿孔素和早期內(nèi)體無共定位。另外，應(yīng)用更具特異性的小干擾RNA（small interferingRNA，siRNA）證實(shí)穿孔素回收途徑：用針對(duì)clathrin 重鏈（clathrin h

9、eavy chain，CHC）的siRNA 干擾NK92細(xì)胞clathrin表達(dá)，48 小時(shí)后，靶細(xì)胞刺激并不導(dǎo)致穿孔素和早期內(nèi)體共定位；而用針對(duì)無關(guān)序列的siRNA 干擾NK92細(xì)胞48 小時(shí)，受靶細(xì)胞刺激后，穿孔素和早期內(nèi)體出現(xiàn)明顯共定位。由此證實(shí)，穿孔素可以由clathrin 內(nèi)吞途徑介導(dǎo)進(jìn)入早期內(nèi)體。
　　 四、抑制穿孔素回收可影響NK92細(xì)胞殺傷功能
　　 用針對(duì)clathrin 內(nèi)吞途徑的抑制劑阻斷穿孔素回收

10、，檢測(cè)對(duì)NK92細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞功能的影響：效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞比例為5:1和10:1，檢測(cè)NK92細(xì)胞對(duì)原代豬內(nèi)皮細(xì)胞（Primary porcine endothelial cells，PEC）和人紅白血病細(xì)胞株（Humanerythroleukemia cell line，K562）的殺傷率；應(yīng)用clathrin 內(nèi)吞途徑抑制劑，NK92細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞殺傷率明顯低于對(duì)照組；用針對(duì)CHC的siRNA 干擾NK92細(xì)胞（48h），導(dǎo)致后者對(duì)靶

11、細(xì)胞殺傷率明顯降低（用針對(duì)無關(guān)序列的siRNA 干擾作為對(duì)照）。
　　 為探討clathrin 途徑依賴的胞吞在NK92細(xì)胞持續(xù)性殺傷靶細(xì)胞中的作用，將效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞比例設(shè)為1:2和1:5，檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)NK92細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞（PEC和K562）的殺傷率。與上述結(jié)果相印證，在效靶細(xì)胞比例倒置的情況下，NK92細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷率隨殺傷時(shí)間延長而逐步增高；抑制clathrin 途徑的內(nèi)吞（化學(xué)抑制劑和siRNA）后，NK92細(xì)胞對(duì)

12、靶細(xì)胞的殺傷率低于對(duì)照（未抑制clathrin 途徑）。
　　 五、人外周血NK細(xì)胞也能夠回收釋放的穿孔素
　　 為觀察原代NK細(xì)胞是否也存在類似現(xiàn)象，用磁珠分離新鮮人外周血NK細(xì)胞（純度>95％），用靶細(xì)胞刺激NK細(xì)胞15分鐘，穿孔素與早期內(nèi)體出現(xiàn)明顯共定位現(xiàn)象，而靜息狀態(tài)下不發(fā)生此現(xiàn)象。同時(shí)，抑制clathrin 介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑，則NK細(xì)胞的殺傷功能降低。
　　 上述結(jié)果表明，clathrin 途徑介導(dǎo)的內(nèi)吞