造血與淋巴組織腫瘤患者紅細胞的天然免疫黏附功能及對nk細胞殺傷活性的影響

1、<p>　　造血與淋巴組織腫瘤患者紅細胞的天然免疫黏附功能及對NK細胞殺傷活性的影響</p><p>　　作者：張乃紅， 馮玫， 鹿育晉 朱鐳， 劉潔， 高鴻鵬， 李為民， 喬振華</p><p>　　【摘要】 本研究探討造血與淋巴組織腫瘤患者紅細胞天然免疫黏附功能及紅細胞對NK細胞殺傷活性的影響。外周血枸櫞酸鈉抗凝，檢測紅細胞在自身血漿條件下對K562細胞的免疫黏附并計算黏附

2、率。用MTT法測定紅細胞對正常NK細胞殺傷K562細胞活性的影響，并與未加紅細胞時進行比較。結果表明：紅細胞對K562細胞形成了"玫瑰花"樣結合。正常人紅細胞對K562細胞的免疫黏附結合率為（15.3±6.4）%，造血與淋巴組織腫瘤患者紅細胞對K562細胞的免疫黏附結合率為（7.6±7.0）%，與正常人相比較顯著下降（t=3.61, p﹤0.001）。不加紅細胞條件下，正常人外周靜脈血NK細胞殺傷

3、K562細胞活性為67%-71%。正常人紅細胞明顯增加NK細胞殺傷K562細胞活性殺傷率為（14.7±5.2）%，造血與淋巴組織腫瘤患者的紅細胞減低NK細胞殺傷K562細胞活性，殺傷率為（4.3±7.6）%，二者比較有顯著差異（t=6.73， p﹤0.0001）。結論：造血與淋巴組織腫瘤患者紅細胞對K562細胞的免疫黏附能力下降，正常人紅細胞明顯增加NK細胞殺傷K562細胞活性，而造血與淋巴組織腫瘤患者的紅細胞減低N

4、</p><p>　　【關鍵詞】 造血組織腫瘤</p><p>　　Erythrocyte Native Immune Adhering Function (ENIAF) in Patients with Hematopoietic and Lymphoid Neoplasms and Its Effect on NK Cell Killing Activity</p>

5、;<p>　　Abstract The objective of this study was to investigate the change of native immune adhering function (ENIAF) in selfplasma of patients with hematologic and lymphoid neoplasms and its effect on the

6、 killing activity of NK cells. The whole blood was anticoagulated with citric acid. 5 μl precipitated red blood cells and 500 μl plasma of patients or controls were directly mixed with 750 μl quantitative K562 cells at

7、37℃ for 30 minutes. One K562 cell attached by one or more erythrocytes was</p><p>　　Key words hematopoietic neoplasm; lymphoid neoplasms; erythrocyte; innate immune adhering function; NK cell</p>

8、<p>　　紅細胞作為天然免疫的一個重要的構成部分，是機體免疫平衡和穩(wěn)定的重要基礎［1］。紅細胞能夠結合、固定、聚集免疫復合物或微生物，將其呈遞給吞噬細胞［2，3］，使吞噬細胞的吞噬作用增強4-6倍。紅細胞具有免疫調(diào)節(jié)作用，能夠增強T細胞依賴的免疫應答，調(diào)節(jié)B細胞的活化及Ig的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)補體的活化過程，還能促進NK細胞的殺傷作用。研究表明，NK細胞直接介入控制AML的復發(fā)；把NK細胞植入NOD/SCID小鼠排斥了植入的AML細

9、胞，這也證明NK細胞對移植的AML有異體反應性。紅細胞的NK細胞增強因子（natural killer cell enhancing factor， NKEF）是抗氧化劑家族的重要成員，它存在于紅細胞質(zhì)內(nèi)，能夠顯著增強NK細胞對K562殺傷活性。</p><p>　　造血與淋巴組織腫瘤患者紅細胞的天然免疫黏附功能及對NK細胞殺傷活性的影響王海濱等［4］建立了紅細胞天然免疫黏附功能的快速檢測方法。該方法操作簡單、重

10、復性高和穩(wěn)定性好。我們應用此方法研究了造血和淋巴組織腫瘤患者紅細胞對K562 細胞的天然免疫黏附功能，用MTT法測定了造血與淋巴組織腫瘤患者紅細胞對正常人來源的NK細胞殺傷K562細胞活性的影響。</p><p><b>　　材料和方法</b></p><p><b>　　病例來源</b></p><p>　　造血與淋巴組

11、織腫瘤患者來源于山西省人民醫(yī)院或山西醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院血液科門診及住院患者，正常對照者為門診體檢的健康人，年齡、性別構成一致，具有可比性?；颊?4例，男性15例，女性9例，年齡19-57歲，其中CML 3例，AML 10例（M3 6例，M4 2例，M5 2例），MDS 1例，ALL 7例，MM 2例，NHL1例。正常對照21例，男性13例，女性8例，年齡18-48歲?；颊哐獦吮静杉瘯r間為初診或化療3周以后，以避免藥物對檢測結果

12、的影響。</p><p><b>　　主要儀器</b></p><p>　　CO2培養(yǎng)箱（Heraeus and LISHEN公司生產(chǎn)），培養(yǎng)瓶（50 ml），超凈工作臺，自動雙重純水蒸餾器（蘇州凈化設備廠生產(chǎn)），高速離心機(centrifuge 5810R型)，水浴鍋，可調(diào)微量加樣器、微量滴頭，普通、倒置顯微鏡（Olympas），骨髓圖象分析儀(天津），細胞記數(shù)板，

13、40孔酶標板，流式細胞儀（Conlter公司產(chǎn)品），酶標儀分光光度計（北京六一儀器產(chǎn)品）。</p><p><b>　　主要試劑</b></p><p>　　1640培養(yǎng)基購自晶美公司，10%胎牛血清，戊二醛，姬姆薩染液。淋巴細胞分離液（Ficoll液），磷酸緩沖液（PBS）， MTT粉末、DMSO購自晶美公司。</p><p><b&g

14、t;　　K562細胞培養(yǎng)</b></p><p>　　K562細胞購自中國科學院細胞庫（上海），放于1640培養(yǎng)液中、在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。于倒置顯微鏡下觀察K562細胞生長情況。根據(jù)細胞密度每36-48小時半量換液次。</p><p>　　紅細胞天然免疫黏附功能檢測</p><p>　　由肘靜脈取全血2 ml，枸櫞酸鈉抗凝， 1 500 r

15、pm離心5分鐘。取500 μl病人血漿和5 μl沉淀的紅細胞，直接加到750 μl新鮮配制的定量靶細胞K562 細胞（濃度為105/ml）懸液中，混勻。37℃，水浴30 分鐘。加1 ml固定緩沖液(0.25 %戊二醛)，輕輕混勻，5分鐘后閱片。閱片要求：取混勻液150 μl加50 μl姬姆薩氏染液，懸浮涂片(玻片的2 /3)。取4個角和中心5區(qū)閱片，每區(qū)閱讀20個靶細胞，結合上紅細胞（1個以上）的靶細胞為1個結合單位，計數(shù)100個靶細

16、胞，計算黏附率（每例標本重復2次，結果取平均值）：</p><p>　　紅細胞黏附率(%) = ［黏附1個以上紅細胞的靶細胞數(shù) / 5區(qū)閱讀的共100個靶細胞］×100%</p><p>　　按常規(guī)方法分離效應細胞（外周血單個核細胞PBMNC），流式細胞儀檢測其CD3-（CD16CD56）+ 細胞即NK細胞的表達（由流式細胞儀直接給出PBMNC中NK細胞的百分率）。</p&

17、gt;<p>　　殺傷活性測定（最佳細胞密度、效/靶比及反應時間由預實驗得到）</p><p>　　以對數(shù)生長期Ｋ562細胞為靶細胞，調(diào)整細胞密度為4×105/ ml。以外周血單個核細胞為效應細胞，用RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度為4×106/ ml，效/靶比為10∶1，同時設靶細胞孔、效應細胞孔和RPMI 1640空白對照孔。上述各孔均設3個復孔。效應細胞、靶細胞、R

18、PMI 1640孔各為50微升/孔（反應孔），效應細胞孔、靶細胞對照孔各為50微升/孔，RPMI 1640孔為100微升/孔加入40孔板；另設1孔加RPMI 1640培養(yǎng)液150微升/孔為調(diào)零點。充分混勻， 37℃、5% CO2培養(yǎng)4小時 。每孔加入20 μl MTT (5 mg/ml)，繼續(xù)孵育4小時（以上都在超凈操作臺操作）。棄上清，每孔加DMSO 150 μl，充分吹打、混勻，10分鐘內(nèi)用酶標儀檢測570 nm波長OD值，按下述公

19、式計算殺傷率。</p><p>　?。危思毎麣?%)=［1 - (實驗孔OD值- 效應細胞孔OD值) / 靶細胞孔OD值］×100%</p><p>　　紅細胞對NK細胞殺傷活性的影響</p><p>　　紅細胞的制備 健康人、造血與淋巴組織腫瘤患者的EDTA抗凝新鮮全血（采集6小時之內(nèi)使用），經(jīng)淋巴細胞分離液（Ficoll）分離得到紅細胞，用生理鹽

20、水洗滌2次。</p><p>　　紅細胞的濃度 用RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度為4×106/ ml備用。紅∶效=1∶1。紅細胞與效應細胞一起放入靶細胞，加入后進行培養(yǎng)，即進行殺傷實驗。以下步驟同 。</p><p><b>　　統(tǒng)計學處理</b></p><p>　　結果用SPSS 11.0軟件進行統(tǒng)計后分析，行獨立樣本檢測

21、 （independentsample T Test）。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±SD）表示； p<0.05，差異有顯著性。</p><p><b>　　結 果</b></p><p>　　枸櫞酸鈉抗凝，在自身血漿條件下紅細胞對K562細胞的免疫黏附形成了"玫瑰花"樣結合（圖1、2）。21例正常對照外周血紅細胞對K56

22、2細胞的免疫黏附結合率為（15.3±6.4）%，24例造血與淋巴組織腫瘤患者紅細胞對K562細胞的免疫黏附結合率為（7.6±7.0）%（表1），與正常人相比顯著下降（t=3.61， p﹤0.001）。</p><p>　　從6名正常對照者外周靜脈血分離外周血單個核細胞，用流式細胞儀檢測PBMNC的CD3-（CD16CD56）+ 細胞即NK細胞，結果顯示NK細胞占PBMNC的比例為7%-30%（

23、圖3），能夠滿足殺傷活性檢測需要。</p><p>　　Figure 3. Expression level of PBMNC CD3+(CD16CD56)+ cells (NK cells) detected by FCM.</p><p>　　不加紅細胞條件下，用MTT法測得6名正常人來源的NK細胞殺傷K562細胞活性為67%-71%。檢測標本時每次設立不加紅細胞的對照，加入紅細胞后測

24、得的結果減去對照，即得到紅細胞增加或減少NK細胞殺傷K562細胞活性的百分率。結果表明，21名正常對照者的紅細胞明顯增加NK細胞殺傷K562細胞活性，殺傷率為（14.7±5.2）%，而24例造血與淋巴組織腫瘤患者的紅細胞明顯地減低NK細胞殺傷K562細胞活性，殺傷率為（-4.3±7.6）%（表2），二者比較有顯著差異（t=6.73， p﹤0.0001）。</p><p><b>　　

25、討 論</b></p><p>　　在外周血中，抗原及腫瘤細胞遇到紅細胞的機會比白細胞大1000倍，結合有抗體或補體的腫瘤細胞可通過C3b受體黏附到紅細胞上，易被吞噬細胞捕獲、吞噬［1］。Craig等［2］通過體外用雙特異性單克隆抗體反應劑連接免疫復合物到紅細胞上的模型系統(tǒng)，揭示了免疫復合物絞鏈紅細胞到巨噬細胞的中間轉移過程。Hament等［3］用流式細胞儀分析表明，在人血清存在下肺炎球菌能結合

26、到人紅細胞上，紅細胞上的配體為補體受體1（CR1）。國內(nèi)郭峰［4］提出了"紅細胞天然免疫主干道理論"并進行了實驗研究［4，5］，他們認為，各種致病性抗原進入血循環(huán)首先旁路激活血漿中的補體等可溶性免疫分子，黏附上補體C3b等免疫分子后絕大多數(shù)被數(shù)量巨大的紅細胞補體受體免疫黏附處理，此后交給各種白細胞，激發(fā)一系列天然免疫與適應性免疫反應，最終將入侵的致病原消除。</p><p>　　王海濱等［6］

27、建立了紅細胞天然免疫黏附功能（ENIAF）的快速檢測方法，在對SARS的研究中獲得了許多原創(chuàng)性的成果。他們發(fā)現(xiàn)確診為SARS的病人在收住院1周內(nèi)其紅細胞天然免疫黏附功能即不同程度地下降，并且隨病情的加重持續(xù)降低，隨病情好轉開始回升，SARS患者的紅細胞CR1數(shù)量下降，與ENIAF的變化密切相關，作者認為ENIAF可作為臨床動態(tài)觀察SARS病情發(fā)展變化、療效評估及預后判斷的重要參考指標［7］。</p><p>　　

28、對造血與淋巴組織腫瘤患者，我們用紅白血病細胞株K562細胞作為靶細胞，外周血枸櫞酸鈉抗凝，在自身血漿中研究患者的紅細胞對K562細胞ENIAF的變化。結果表明，紅細胞在自身血漿條件下對K562細胞的免疫黏附形成了"玫瑰花"樣結合，患者紅細胞對K562細胞的免疫黏附結合率為（7.6±7.0）%，與正常人的（15.3±6.4）%相比顯著下降（t = 3.61， p﹤0.001）。其他腫瘤患者紅細胞的黏

29、附功能與正常人的相比也明顯低下［8］。</p><p>　　ENIAF的變化與血沉、淋巴細胞絕對值的變化顯著相關, 與合并糖尿病、慢性肝炎也有關系［9］。自身免疫性肝病患者紅細胞免疫黏附活性顯著低于正常人群（p﹤0.01），并且與自身抗體的升高、病情嚴重程度密切相關［10］。造血與淋巴組織腫瘤患者中ENIAF變化的原因與意義，尚需要進一步研究。</p><p>　　NK細胞殺傷活性檢測多用

30、敏感細胞株如K562細胞，方法有MTT比色法、LDH釋放法、3HTdR參入法等。崔曉明等［11］研究結果表明，K562細胞數(shù)在（1-4）×104/孔時線性關系較好，效、靶作用的時間定為2小時，加MTT后再作用4小時，效、靶比選擇5∶1、10∶1結果較理想。王琦等［12］對MTT比色法進行了改良，同時證明MTT比色法與3HTdR摻入法有高度的相關性（r = 0.96， p<0.01）。</p><p

31、>　　我們采用MTT法測定NK細胞殺傷K562細胞的活性，發(fā)現(xiàn)不加紅細胞條件下，殺傷活性為67%-71%，與上面的結果一致。正常人紅細胞能使NK細胞殺傷K562細胞活性的百分率明顯增加（14.7±5.2）%，造血與淋巴組織腫瘤患者的紅細胞卻使NK細胞殺傷K562細胞活性明顯降低（4.3±7.6）%，其原因需要進一步研究。對破壞的紅細胞劉希英等［13］作了探討，他們制備紅細胞胞質(zhì)液，觀察紅細胞胞質(zhì)液對NK細胞殺

32、傷活性的影響。發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤病人NK細胞活性明顯低于正常對照組（F= 12.85， q = 7.86， p<0.01）；正常人紅細胞胞質(zhì)液可以顯著提高自身及病人NK細胞活性（F= 4.32-5.89， q = 3.96-4.49， p<0.05、0.01）。</p><p>　　在造血系統(tǒng)，許多證據(jù)提示NK細胞參與抗白血病免疫反應［14］，NK細胞數(shù)量或活性與急性白血病的預后之間存在負相關，NK細胞活性

33、依賴性的免疫缺陷綜合征與淋巴、造血系統(tǒng)腫瘤發(fā)生率升高有關，NK細胞在異基因骨髓移植中的GVL效應中起重要作用。Miller等［15］對NK細胞治療抗白血病的作用進行了研究，結果顯示在較強的免疫抑制方案（HiCy/Flu）后輸注NK細胞造成了內(nèi)源性IL15的明顯上升及供體NK細胞的擴增，并且在19例預后不佳的AML患者中5例產(chǎn)生了完全血液學緩解。</p><p>　　所以，紅細胞可能影響NK細胞殺傷腫瘤細胞的活

34、性。進一步研究造血與淋巴組織腫瘤患者紅細胞免疫與NK細胞免疫、DC功能、T、B細胞免疫等之間的關系，對于揭示其發(fā)病機制、發(fā)展更全面的治療策略可能具有重要的意義。</p><p><b>　　【參考文獻】</b></p><p>　　1郭峰，錢寶華，張樂之主編. 現(xiàn)代紅細胞免疫學. 上海：上海第二軍醫(yī)大學出版社. 2002：40</p><p>

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