腎移植急性排斥反應(yīng)IL-15、穿孔素及顆粒酶B mRNA表達(dá)的實驗與臨床研究.pdf

1、盡管近年來免疫抑制劑種類不斷增加，但移植后急性排斥反應(yīng)（acute rejection，AR）仍然是導(dǎo)致移植腎失功的重要原因。急性排斥反應(yīng)的早期診斷及干預(yù)，對移植腎功能的恢復(fù)至關(guān)重要。雖然移植腎穿刺活檢仍然是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但大部分臨床醫(yī)生以及患者更愿意接受非侵襲性的診斷方法。隨著對急性排斥反應(yīng)分子生物學(xué)的深入研究，細(xì)胞因子在器官移植急性排斥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展中的作用受到廣泛重視。移植術(shù)后對某些細(xì)胞因子的表達(dá)進(jìn)行檢測并干預(yù)以防治急性排斥反應(yīng)

2、是當(dāng)前器官移植領(lǐng)域的研究熱點。 已知白細(xì)胞介素2（IL—2）在腎移植AR中起重要作用，通過抑制IL—2受體（IL—2R）能有效的預(yù)防AR。但是即使如此，動物實驗和臨床移植中阻斷IL—2/IL—2R仍不可能完全控制AR的發(fā)生，說明機(jī)體內(nèi)存在有獨立于IL—2/IL—2R系統(tǒng)之外的其他的T細(xì)胞激活途徑。白細(xì)胞介素15（IL—15）是由單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等非T淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，最近的研究表明，它是CD8記憶T細(xì)胞增殖和活化的重要

3、因子，在肝臟移植的急性排斥反應(yīng)早期，可以檢測到IL—15的表達(dá)高表達(dá)。穿孔素和顆粒酶B是細(xì)胞毒性T細(xì)胞分泌的因子，在急性排斥反應(yīng)發(fā)生時被釋放并攻擊移植物。雖然對腎移植早期急性排斥反應(yīng)時穿孔素（PFP）和顆粒酶B（GraB）的檢測已有研究報道，但對于IL—15在腎移植AR發(fā)生時的作用以及它與PFP和GraB表達(dá)的關(guān)聯(lián)性尚未見報道。本研究在動物實驗和臨床試驗中探討了IL—15、PFP和GraB在腎移植AR發(fā)生時的表達(dá)變化，以及IL—15在其

4、中的作用。研究分三個部分： 第一部分:建立大鼠同種異體腎移植模型 目的：建立穩(wěn)定的同種異體大鼠腎移植模型，為開展大鼠腎移植相關(guān)研究奠定良好的實驗基礎(chǔ)。 方法：分別采用WISTAR大鼠和SD大鼠作為供受體，將供腎動脈帶有的腹主動脈瓣與受體腹主動脈作端側(cè)二定點外翻連續(xù)縫合；供體腎靜脈帶有的下腔靜脈瓣與受體下腔靜脈作端側(cè)兩定點外翻連續(xù)縫合。尿路重建采用供體輸尿管膀胱瓣與受體膀胱吻合。 結(jié)果：手術(shù)總時間平均為（9

5、0±10）min。手術(shù)成功率為86%。 結(jié)論：此模型有較高的成功率和AR發(fā)生率，符合大鼠腎移植實驗研究的需要。 第二部分:阻斷IL—15對大鼠腎臟移植急性排斥反應(yīng)細(xì)胞毒性作用的研究 目的:研究阻斷IL—15對大鼠腎臟移植急性排斥反應(yīng)細(xì)胞毒性作用的影響。 方法：分別以WISTAR大鼠和SD大鼠作為供受體，建立大鼠同種異體腎移植模型。實驗分四組（n≥15/組）：（1）同基因移植組（對照組，Ctrl）；（2）急

6、性排斥反應(yīng)（AR）組，術(shù)后無藥物處理；（3）環(huán)孢素A（CsA）治療組，術(shù)后經(jīng)腹腔注射CsA針劑6mg.kg—1.d—1；（4）IL—15抗體（AB）治療組，術(shù)后經(jīng)腹腔注射IL—15抗體0.5mg/kg。以real—time PCR方法分別檢測受體外周血和移植腎組織中IL—15、PFP和GraB的mRNA表達(dá)，并作移植腎AR病理學(xué)分析研究。 結(jié)果：（1）AR、CsA及AB組術(shù)后移植腎組織及外周血中均出現(xiàn)IL—15、PFP和GraB

7、 mRNA表達(dá)水平上調(diào)，第3～5天達(dá)到高峰，第7天逐漸下降，與Ctrl組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義；（2）AR組與AB和CsA組比較，移植腎組織及外周血中IL—15、PFP和GraB mRNA表達(dá)均明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），其中PFP和GraB mRNA表達(dá)上調(diào)較IL—15 mRNA更為明顯（P<0.05）；（3）AB組與AR組及CsA組比較，移植腎組織及外周血中IL—15 mRNA表達(dá)均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.

8、05）；（4）移植腎病理組織檢查，Ctrl組和CsA組未見明顯AR征象，AR組呈現(xiàn)重度AR反應(yīng)，AB組AR征象較輕微。（5）三個細(xì)胞因子的表達(dá)變化在移植腎組織和外周血中差異無顯著意義。 結(jié)論：（1）AR發(fā)生早期IL—15、PFP和GraB在移植腎組織及外周血中均出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，IL—15可能是存在與IL—2之外的參與AR發(fā)生的另一途徑；（2）AR發(fā)生時IL—15 mRNA的高表達(dá)與GraB和PFP的mRNA表達(dá)上調(diào)之間存在密切關(guān)聯(lián)

9、：（3）AR早期阻斷受體內(nèi)IL—15的表達(dá)，可降低GraB和PFP mRNA的表達(dá)，并抑制它們引起的細(xì)胞毒殺傷作用，從而保護(hù)移植物，減輕AR程度。（4）GraB、PFP和IL—15 mRNA的高表達(dá)可以作為診斷同種異體腎移植AR早期的重要指標(biāo)。檢測受體外周血中IL—15、PFP和GraB的mRNA表達(dá)水平，可以作為早期診斷AR的一種非侵襲性的檢測方法。并且對判斷AR的程度、治療效果及預(yù)后均有一定的指導(dǎo)價值。 第三部分:腎移植急性

10、排斥反應(yīng)患者血清白細(xì)胞介素15、穿孔素及顆粒酶B mRNA的表達(dá) 目的:探討IL—15、PFP和GraB mRNA檢測在腎移植術(shù)后早期AR診斷及其與感染鑒別診斷中的價值。 方法：采用SYBR GreenⅠ實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（FQ—PCR）方法動態(tài)檢測45例腎移植患者外周血淋巴細(xì)胞（PBL）中IL—15、PFP及GraB mRNA表達(dá)的變化。 結(jié)果：（1）AR組IL—15、PFP及GraB mRNA的表

11、達(dá)均高于術(shù)前及腎功能穩(wěn)定組（P<0.05），較臨床癥狀出現(xiàn)早2～3天，經(jīng)激素沖擊治療后，AR均得到逆轉(zhuǎn)，同時PFP、GraB和IL—15 mRNA的表達(dá)減弱（P<0.05）。（2）與術(shù)前及腎功能穩(wěn)定組比較，細(xì)菌感染組PFP和GraB mRNA的表達(dá)水平亦上升（P<0.05），抗感染治療后表達(dá)水平下調(diào)。但I(xiàn)L—15 mRNA的表達(dá)水平均未見明顯升高（P>0.05）。（3）CsA中毒組三項指標(biāo)在監(jiān)測過程中均未見明顯變化。 結(jié)論：

12、 1.FQ—PCR動態(tài)測定PBL中IL—15、PFP及GraB mRNA表達(dá)是一種無創(chuàng)、較敏感的早期檢測AR的方法，并可以預(yù)測抗AR的治療效果。 2.IL—15作為CD8記憶T細(xì)胞生長和活化必須的細(xì)胞因子，可能是介導(dǎo)AR發(fā)生的重要因子。 3.IL—15 mRNA的表達(dá)水平在細(xì)菌感染發(fā)生時并不升高，而PFP和GraB卻在患者發(fā)生AR和細(xì)菌感染時均有表達(dá)上調(diào)，因此同時檢測這三個細(xì)胞因子，才能對AR和細(xì)菌感染作出鑒別診斷有