急性移植排斥反應過程中HLA-G表達動態(tài)變化的實驗及臨床研究.pdf

1、背景： 器官和組織移植是20世紀的醫(yī)學壯舉，為挽救人類生命做出了超乎尋常的貢獻。隨著組織配型、器官保存、移植手術、術后抗感染等一系列臨床技術的不斷進步，移植器官的存活率以及患者的生活質量和生存率都得到了很大的提高，使得器官移植成為治療終末期器官功能衰竭最有效的治療手段。 然而，移植術后的排斥反應，尤其是急性排斥反應，仍然是導致移植器官功能喪失、甚至患者死亡最主要的原因。盡管移植物局部組織的病理活檢可以對排斥反應做出明確診

2、斷，而且一直被公認為是診斷移植排斥反應的金標準，但由于其具有創(chuàng)傷性、容易誘發(fā)并發(fā)癥等缺點，在臨床上難以成為常規(guī)的檢查手段；臨床常用的生化學等檢查只有在移植器官組織結構明顯異常，影響到器官功能時才能做出診斷。而目前研究較多的細胞因子、抗體等檢查，則往往由于其準確性、敏感性、特異性方面的不足而無法得到廣泛的應用。到目前為止，仍沒有一種可以及時、準確診斷排斥反應的公認的檢測方法。 在無法準確了解患者免疫狀態(tài)的情況下，免疫抑制劑是預防排

3、斥反應發(fā)生的最有效的手段，但過量的免疫抑制劑往往導致嚴重感染和腫瘤等惡性疾病的發(fā)生。 因此如何通過一種無創(chuàng)性的檢測方法準確地反映患者的免疫狀態(tài)并及時發(fā)現(xiàn)、預測排斥反應的發(fā)生是移植研究領域一個亟待解決的重大課題。只有這樣，才能在預防排斥反應和減少免疫抑制劑用量之間尋找到一個適宜的平衡點，制定個性化的治療方案，達到最佳的治療效果。 以往相關研究主要從淋巴細胞活化的角度加以研究，但從另一方面看，移植術后穩(wěn)定的患者大多處于免疫抑

4、制或免疫耐受狀態(tài)，而發(fā)生排斥的患者則是打破了業(yè)已建立的免疫抑制狀態(tài)而使得免疫細胞重新激活并發(fā)揮同種異體殺傷作用。那么能否從免疫耐受的角度著手，借觀察宿主免疫耐受相關因素的變化來預測排斥反應的發(fā)生呢? 胚胎植入是誘導免疫耐受最成功的典范，從本質上看，胚胎植入的過程，其實就是母體對帶有父方異體抗原成分的胚胎的免疫耐受過程。器官移植和胚胎植入是兩個密切相關的研究領域，雖然同樣是同種異體之間的免疫應答，胚胎植入和器官移植的結局卻截然相反

5、，這其中涉及很多種蛋白和分子的參與。其中非經典主要組織相容性復合體（MHC），尤其是HLA-G的差異性表達，引起了越來越多胚胎學研究和病理妊娠研究領域專家的重視。 HLA-G是一種非經典MHC-Ⅰ類抗原，與經典MHC-Ⅰ類抗原的基因高度同源，蛋白結構也很相似。不同的是，HLA-G分子不具有豐富的多態(tài)，也不像經典MHC-Ⅰ抗原那樣分布廣泛。生理狀態(tài)下HLA-G僅表達于胚胎滋養(yǎng)層和一些免疫豁免部位。從功能上看，HLA-G分子可與N

6、K細胞、T細胞和APC細胞等免疫細胞的抑制性受體結合，傳遞抑制性信號，從而抑制母體免疫細胞的活性，誘導母體對胚胎抗原的免疫耐受。母胎界面HLA-G表達下降與流產、子癇等病理妊娠的發(fā)生密切相關。 胚胎學的研究成果為器官移植免疫的研究提供了新的思路。那么從器官移植的角度來看，移植術后HLA-G的表達是否呈現(xiàn)出規(guī)律性的變化?排斥反應發(fā)生時，HLA-G的表達是否會有相應的變化?是否有助于臨床上排斥反應的診斷呢?免疫抑制劑對機體HLA-G

7、的表達有怎樣的影響作用呢?這一系列問題尚未引起人們的重視。如果解決了上述問題，將有助于闡述HLA-G分子在器官移植中的作用機制，為臨床排斥反應的診斷提供新的思路。 臨床上，移植受者術后常規(guī)接受免疫抑制劑治療以誘導耐受，因此難以區(qū)分移植排斥反應和免疫抑制劑對HLA-G的不同作用，因而有必要利用動物模型來系統(tǒng)研究移植排斥反應發(fā)生過程中HLA-G分子表達的變化規(guī)律，并獨立探討免疫抑制劑對其的影響作用。 小鼠的Qa-2分子與人類

8、HLA-G分子在結構和功能上均具有高度的同源性，而且純系小鼠之間的皮膚移植模型是最經典的排斥反應動物模型，手術簡便，易于觀察。因此小鼠皮膚移植模型成為本次研究的理想動物模型。 為了系統(tǒng)的研究移植排斥反應發(fā)生過程中HLA-G分子表達的變化規(guī)律以及免疫抑制劑的影響作用，我們首先以近交系小鼠皮膚移植模型研究了移植術后不同時間移植物、浸潤淋巴細胞、外周血淋巴細胞（PBLs）以及血漿中Qa-2的表達，分析了其與移植排斥反應分級之間的相關性

9、和不同劑量免疫抑制劑的影響作用。并在動物研究的基礎上，動態(tài)監(jiān)測了臨床腎移植術后穩(wěn)定患者和排斥患者術后不同時間外周血單個核細胞以及血漿HLA-G的不同表達，探討了HLA-G對移植物排斥反應的診斷價值，并分析了其與患者免疫耐受狀態(tài)之間的關系，以期為臨床制定個性化免疫抑制方案提供實驗依據(jù)。 目的： 1、利用成功建立的小鼠皮膚移植模型，動態(tài)監(jiān)測用藥和不用藥狀態(tài)下移植受者術后不同時間小鼠Qa-2分子在移植物、浸潤淋巴細胞、外周血淋

10、巴細胞、血漿中的表達變化，揭示移植受者Qa-2分子在移植排斥反應發(fā)生過程中的變化規(guī)律，探討其與同種異體急性移植排斥反應發(fā)生進程之間的對應關系。 2、通過檢測不同種類、不同劑量免疫抑制劑單一或聯(lián)合作用下小鼠Qa-2表達的變化，分析免疫抑制劑種類和劑量對Qa-2表達的不同作用，探討Qa-2表達對機體免疫抑制狀態(tài)的監(jiān)測價值，以期為指導臨床制定個性化治療方案提供實驗依據(jù)。 3、動態(tài)監(jiān)測腎移植患者術前和術后不同時間外周血單個核細胞

11、HLA-G轉錄和蛋白水平以及血漿可溶性HLA-G表達的變化規(guī)律，對比穩(wěn)定組和排斥組的差異，探討HLA-G對于移植排斥反應的診斷價值、最佳檢測方法以及對患者免疫狀態(tài)的監(jiān)測作用。 方法： 1．建立小鼠皮膚移植動物模型：為研究不同鼠系之間的差別，分別以SPF級近交系C57BL/6（簡稱C57）和BALB/C（簡稱BA）兩種鼠系作為研究對象，分別隨機分為正常對照組和手術組，其中手術組又分為自身移植組、同系移植組和異系移植組。為了

12、觀察免疫抑制劑的影響，同系和異系移植組又分別分為不用藥組和用藥組。用藥組模擬臨床環(huán)孢素A（CsA）、皮質激素（Horm）及霉酚酸酯（MMF）中等劑量三聯(lián)用藥。手術組采用經典的小鼠背一背皮膚移植手術方法，建立動物模型，術后每天觀察皮膚移植物大體改變，記錄肉眼排斥時間。每天取移植皮片進行HE染色，根據(jù)移植物病理組織學改變將其分為排斥反應Ⅰ-Ⅳ級，記錄移植物病理排斥進展情況。觀察用藥和不用藥對移植物存活時間和病理組織學改變的影響 2．

13、動態(tài)檢測移植術后Qa-2的表達：利用成功建立的小鼠皮膚移植模型，術后每天每組處死5只小鼠，采集移植皮片、外周血淋巴細胞和血漿，采用免疫組化、Real-Time熒光定量PCR、流式細胞術和ELISA等方法動態(tài)監(jiān)測不同組別小鼠移植受者術后不同時間點小鼠Qa-2分子在移植物、浸潤淋巴細胞、外周血淋巴細胞、血漿中的表達變化，分析上述指標與排斥反應發(fā)生和免疫抑制劑應用之間的關系。 3．免疫抑制劑對Qa-2表達的影響：將SPF級C57BL/

14、6小鼠隨機分為對照組、環(huán)孢素組、激素組、霉酚酸酯組和聯(lián)合用藥組，其中三種單一用藥組又分為低、中低、中等、中高、高共5個劑量組，收集外周血淋巴細胞、血漿以及移植物，采用Real-Time熒光定量PCR、流式細胞術、ELISA及免疫組化等方法檢測不同種類、不同劑量免疫抑制劑單一作用或聯(lián)合作用下小鼠Qa-2表達的變化，分析了免疫抑制劑種類和劑量對Qa-2表達的不同作用，探討了Qa-2表達對機體免疫抑制狀態(tài)的監(jiān)測價值，以期為指導臨床制定個性化治

15、療方案提供實驗依據(jù)。 4．腎移植患者HLA-G的動態(tài)監(jiān)測：連續(xù)收集57例腎移植患者（其中術后32例腎功能穩(wěn)定、25例發(fā)生急性排斥反應）術前和術后不同時間（術后3天、7天、2周、3周、1月、2月、3月以上）外周血標本。懷疑排斥的患者及時進行腎活檢明確診斷，并于沖擊治療前、排斥反應發(fā)生后3天、7天、2周、3周以上分別收集標本。采用Real-Time熒光定量PCR、流式細胞術和ELISA等方法動態(tài)檢測移植受者外周血淋巴細胞HLA-G轉

16、錄和蛋白水平以及血漿可溶性HLA-G表達的變化規(guī)律，對比分析穩(wěn)定組和排斥組的差異，探討HLA-G對于移植排斥反應的診斷價值、最佳檢測方法。 結論： 1、通過動態(tài)監(jiān)測移植術后不同時間小鼠Qa-2的表達變化規(guī)律，首次發(fā)現(xiàn)：移植術后早期，尤其是在用藥狀態(tài)下，移植物浸潤淋巴細胞、外周血淋巴細胞Qa-2表達水平明顯下調，發(fā)生于淋巴細胞活化的階段。這一階段尚未造成嚴重的移植物損傷，遠遠早于肉眼排斥的發(fā)生。 2、免疫抑制劑可明

17、顯提高移植物、浸潤淋巴細胞、外周血淋巴細胞HLA-G的表達，同時延長移植物存活時間，但過高劑量作用反而有所下降。免疫抑制劑中等劑量聯(lián)合應用不但可以達到最大限度上調HLA-G表達的作用，而且對動物的毒性較小，是最佳選擇。 3、臨床檢測結果顯示：腎移植術后外周血HLA-G的表達，尤其是CD4+T細胞HLA-G的動態(tài)改變，與免疫抑制劑用藥時間和劑量密切相關，并在排斥反應發(fā)生時明顯下調，有可能成為一種反映移植患者免疫耐受狀態(tài)和診斷排斥反