攜帶HLA-G慢病毒轉(zhuǎn)染大鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞及對(duì)抗大鼠肝移植排斥反應(yīng)的研究.pdf

1、目的:人類白細(xì)胞抗原G(HLA-G)因?yàn)樵谀阁w胎兒之間的免疫耐受中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用而被注意，提示它可能應(yīng)用于器官移植。HLA-G在體外誘導(dǎo)表達(dá)已被證實(shí)有誘導(dǎo)免疫耐受的特性，移植術(shù)后患者體內(nèi)HLA-G的表達(dá)已被證實(shí)與移植術(shù)后急性和慢性排斥反應(yīng)發(fā)生率降低有關(guān)。我們使用轉(zhuǎn)染攜帶人HLA-G基因的慢病毒轉(zhuǎn)染大鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞及大鼠移植肝臟，在體外及在體條件下探討HLA-G的表達(dá)是否有直接保護(hù)移植肝臟免受排斥反應(yīng)損傷的效果。
　　方法:

2、r>　　1、取260只健康雄性SD大鼠，分三個(gè)階段進(jìn)行，先建立大鼠原位肝移植模型的手術(shù)訓(xùn)練和探索。手術(shù)熟練后，取40只SD大鼠和40只Wistar大鼠，建立SD至Wistar大鼠肝移植急性移植排斥反應(yīng)模型。
　　2、建立攜帶HLA-G的慢病毒表達(dá)體系。
　　3、進(jìn)行SD大鼠肝細(xì)胞原代培養(yǎng)。
　　4、將攜帶人HLA-G的慢病毒轉(zhuǎn)染SD大鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后7天，通過免疫熒光、RT-PCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)

3、進(jìn)行檢測(cè)，分別從病毒轉(zhuǎn)染、mRNA水平和蛋白水平全面評(píng)價(jià)HLA-G慢病毒轉(zhuǎn)染的效果。
　　5、采用kamada二套管法建立SD和Wistar大鼠的原位肝移植模型45例，隨機(jī)分為三組，每組15例。實(shí)驗(yàn)組在SD大鼠的供體肝臟取下后，從門靜脈輸注2ml包含有107TU/ml攜帶HLA-G基因的慢病毒，將攜帶人HLA-G的慢病毒轉(zhuǎn)染大鼠供肝，與不加任何處理的對(duì)照組和術(shù)后規(guī)律使用FK506的對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比，對(duì)比術(shù)后三組肝組織中的HLA-G的

4、表達(dá)水平、術(shù)后第7天、第14天和第56天的AST和BIL值以及病理切片、術(shù)后生存天數(shù)。探討攜帶HLA-G基因的慢病毒轉(zhuǎn)染供肝，是否可對(duì)抗大鼠急性肝移植排斥反應(yīng)。
　　結(jié)果:
　　1、經(jīng)訓(xùn)練，成功建立SD至Wistar大鼠肝移植急性移植排斥反應(yīng)模型。
　　2、攜帶人HLA-G的慢病毒可成功轉(zhuǎn)染SD大鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞。
　　3、轉(zhuǎn)染攜帶有HLA-G慢病毒的實(shí)驗(yàn)組術(shù)后7天大鼠的AST和BIL值，與術(shù)后使用FK506的對(duì)

5、照組差別有顯著性(P＜0.05)，與術(shù)后不加處理的對(duì)照組差別有極顯著性（P＜0.01）。轉(zhuǎn)染攜帶有HLA-G慢病毒的實(shí)驗(yàn)組術(shù)后12天、56天大鼠的AST和BIL值，與術(shù)后使用FK506的對(duì)照組差別有顯著性（P＜0.01）;轉(zhuǎn)染攜帶有HLA-G的實(shí)驗(yàn)組的AST和BIL值，與術(shù)后不加處理的對(duì)照組差別有極顯著性（P＜0.01）。對(duì)照組中位生存時(shí)間12.00天，F(xiàn)K506組中位生存時(shí)間70.50天， HLA-G組中位生存時(shí)間91.50天，各組之

6、間差別有顯著性（P＜0.01）。提示這種治療可延長(zhǎng)受體大鼠的存活期。病理切片結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染攜帶有HLA-G慢病毒的實(shí)驗(yàn)組和術(shù)后使用FK506的陽(yáng)性對(duì)照組，術(shù)后7天病理切片僅有輕度排斥反應(yīng)，而術(shù)后不加任何處理的陰性對(duì)照組則顯示為重度排斥反應(yīng)。術(shù)后56天，F(xiàn)K506組病理切片顯示存在輕度排斥反應(yīng)，而HLA-G組無排斥反應(yīng)。
　　結(jié)論:
　　1、轉(zhuǎn)染攜帶有HLA-G慢病毒作為治療性的手段用于大鼠肝移植急性排斥反應(yīng)模型，能有效保護(hù)大