肝再生增強因子防治大鼠肝移植急性排斥反應(yīng)實驗研究.pdf

1、目的：(1)通過建立大鼠原位肝移植動物實驗，觀察從Lewis大鼠供體到BN大鼠受體肝移植后移植肝臟能否產(chǎn)生急性排斥反應(yīng)，以及輸入肝再生增強因子(Agumenter of liver regeneration，ALR)后，對移植肝臟免疫急性排斥反應(yīng)(Acute rejection，AR)的影響。(2)觀察移植肝臟中Th1淋巴細胞因子IL-2和IFN-γ基因和蛋白質(zhì)的表達以及肝臟內(nèi)淋巴細胞的凋亡率和活化率，以了解ALR對肝臟內(nèi)淋巴細胞的影響

2、。(3)觀察移植肝臟中枯否細胞(Kupffer cells，KCs)細胞因子TNF-α和IL-2基因和蛋白質(zhì)的表達變化，闡明ALR對KCs功能的影響。(4)通過體外分離培養(yǎng)脾臟淋巴細胞和肝臟KCs，觀察KCs在ALR抑制脾臟淋巴細胞的增殖活化、凋亡和細胞因子表達的作用，探討KCs在ALR改善大鼠肝移植后急性排斥反應(yīng)中的作用機制。通過以上四部分實驗，試圖闡明ALR在大鼠原位肝移植急性排斥反應(yīng)中的作用及其確切機制。 方法：(1)按“

3、二袖套法”建立近交系大鼠原位肝移植動物模型，將大鼠分為3組：①同基因移植組(Isograft group)，②同種異基因組(Allograft group)，③同種異基因ALR干預(yù)組(ALR group)。后者于移植后用ALR 100μg/kg經(jīng)尾靜脈注入受體大鼠體內(nèi)，以后每日腹腔內(nèi)注射ALR 100μg/kg至處死受體大鼠。分別于術(shù)后3天、5天和7天活殺，收集標本。觀察各組受鼠存活率；急性排斥反應(yīng)組織病理學(xué)分級按Banff標準進行，各

4、項評分的總和為最終急性排斥反應(yīng)評分，即急性排斥反應(yīng)指數(shù)(rejection activity index，RAI)；全自動生化分析法測定血漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和總膽紅素(TBIL)水平變化，確定近交系大鼠同種異基因肝移植后急性排斥反應(yīng)的形成及ALR對移植肝臟急性排斥反應(yīng)的影響。(2)肝移植7天后分離上述三組動物肝臟淋巴細胞，對分離淋巴細胞用流式細胞儀檢測淋巴細胞活化率和凋亡率，用real time-PCR法測定淋

5、巴細胞中IFN和IL-2基因表達，用免疫組化法和Western blot蛋白印跡等方法測定淋巴細胞中IFN和IL-2蛋白質(zhì)表達；探討ALR減輕大鼠肝移植后急性排斥反應(yīng)的機制。(3)按上述方法建立大鼠肝移植動物模型和進行動物分組，于肝移植術(shù)后7天活殺動物取其肝臟分離KCs，提取KCs中的總蛋白和總RNA，用免疫組化法測定肝組織中TNF-α和IL-10的基因表達，用Western blot蛋白印跡法和Real time-PCR法測定KCs中

6、TNF-α和IL-10基因和蛋白質(zhì)的表達，探討ALR對肝移植后KCs功能的影響，闡明ALR減輕大鼠肝移植后急性排斥反應(yīng)的機制。(4)分別分離BN大鼠KCs和Lewis大鼠脾臟淋巴細胞。共分為4組：①ConA 5μg/ml+脾臟淋巴細胞(A組)，②ConA 5μg/ml+脾臟淋巴細胞+30μg/ml ALR(B組)，③ConA 5μg/ml+脾臟淋巴細胞+KCs(C組)，④ConA 5μg/ml+脾臟淋巴細胞+KCs+30μg/ml AL

7、R(D組)。用流式細胞儀檢測各組脾臟淋巴細胞凋亡率和活化率；H3摻入法檢測脾臟淋巴細胞增殖；ELISA檢測各組IL-2、IL-10、IFN-γ和TNF-α細胞因子水平。 結(jié)論：(1)在未應(yīng)用任何免疫抑制劑的情況下，從Lewis大鼠供體到BN大鼠受體之間的同種異基因原位肝移植術(shù)后7天產(chǎn)生明顯的急性排斥反應(yīng)，首次證實ALR能夠明顯減輕同種異基因原位肝移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)，改善肝功能，降低死亡率，延長生存時間。(2)首次證實ALR減輕

8、同種異基因原位肝移植后急性排斥反應(yīng)與ALR降低肝臟內(nèi)IL-2和IFN-γ表達，進而抑制肝臟內(nèi)Th1淋巴細胞活化促進凋亡有關(guān)。(3)首次證實ALR可能通過調(diào)節(jié)肝移植后移植肝臟內(nèi)KCs細胞因子的表達抑制抑制肝臟內(nèi)Th1淋巴細胞的功能，進而抑制急性排斥反應(yīng)。(4)首次發(fā)現(xiàn)ALR可以直接作用于淋巴細胞，抑制淋巴細胞增殖活化，但是不能直接促進其凋亡。(5)首次證實ALR促進淋巴細胞凋亡與ALR調(diào)節(jié)KCs中細胞因子的表達，使KCs中TNF-α基因和