FTY720防治大鼠角膜移植排斥反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、我國(guó)約有400多萬因角膜病致盲的患者，角膜移植術(shù)是其有效的復(fù)明手段。雖然角膜移植是目前同種器官移植中成功率最高的一種組織移植術(shù)，但穿透性角膜移植的排斥反應(yīng)發(fā)生率仍占10％～30％，對(duì)于高危組病人(High-riskkeratoplasty patients)如：受體眼表新生血管化、持續(xù)炎癥、大植片移植、第二次移植等，排斥發(fā)生率可高達(dá)60％以上，與其他器官移植(如腎臟、心臟和肝臟)的排斥率接近。因此，對(duì)于角膜移植整體而言，免疫排斥反應(yīng)是角

2、膜移植失敗的主要原因。如何降低和預(yù)防角移術(shù)后排斥反應(yīng)已成為目前臨床亟待解決的問題，而尋找高效低毒的免疫抑制劑是解決此問題的研究熱點(diǎn)之一。目前以環(huán)孢霉素A(CsA)為主的免疫抑制劑在臨床己得到廣泛應(yīng)用。但是，CsA的毒副作用較為明顯，比如：腎毒性、高血壓、糖尿病、神經(jīng)系統(tǒng)毒性以及免疫抑制劑常有的并發(fā)感染和誘生腫瘤等；同時(shí)其治療作用有限，對(duì)已產(chǎn)生排斥反應(yīng)者，CsA不能起到很好的逆轉(zhuǎn)作用。所以，研究開發(fā)新型高效、低毒的免疫抑制劑，一直是各國(guó)學(xué)

3、者關(guān)注的熱點(diǎn)。 FTY720是從冬蟲夏草寄生蟬幼蟲的培養(yǎng)液中提取的抗生素成分ISP-1，并進(jìn)行化學(xué)修飾的具有顯著免疫抑制作用的合成藥物，F(xiàn)TY720在嚙齒類動(dòng)物的皮膚、心臟、腎、肝臟及胰島的同種移植和犬科動(dòng)物的肝、腎同種移植實(shí)驗(yàn)中都顯示出良好的免疫抑制活性。它能夠顯著延長(zhǎng)移植物和移植受者的存活時(shí)間，其作用呈劑量依賴性。但此藥物應(yīng)用于角膜移植方面的報(bào)道很少，且尚未見局部使用的報(bào)道。FTY720的作用機(jī)制獨(dú)特，不同于傳統(tǒng)的免疫抑制劑

4、。其藥理作用是能迅速、明顯地降低外周血淋巴細(xì)胞(PBL)，特別是T細(xì)胞數(shù)量，使淋巴細(xì)胞“歸巢”于外周淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)和Payer’s結(jié)中，而且作用可逆。這樣可以將淋巴細(xì)胞“隔絕"于次級(jí)淋巴組織，保護(hù)移植物免受淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)和攻擊。但關(guān)于FTY720對(duì)角膜移植模型大鼠術(shù)后血淋巴細(xì)胞的長(zhǎng)期影響目前報(bào)道很少。 FTY720與常規(guī)免疫抑制劑CsA具有協(xié)同作用，對(duì)嚙齒類和靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型給予亞劑量的CsA和FTY720可顯著延長(zhǎng)移植物的

5、存活時(shí)間，可明顯減少因?yàn)镃sA所引起的毒副作用。 與CsA等免疫抑制劑不同，在使用FTY720期間機(jī)體沒有出現(xiàn)機(jī)會(huì)感染，治療劑量的FTY720未出現(xiàn)類似CsA的肝、腎、神經(jīng)毒性和糖脂類代謝異?；蜻^度免疫抑制現(xiàn)象。 本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠穿透性角膜移植模型，觀察全身使用FTY720對(duì)大鼠角膜移植排斥反應(yīng)的影響，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)大鼠外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量以及某時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)角膜植片的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和白介素-2受體(IL-2R)的表

6、達(dá)，從而進(jìn)一步探討FTY720的作用機(jī)制，為今后抗角膜移植排斥反應(yīng)的臨床藥物治療提供新的選擇以及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 研究目的： 1．藥效學(xué)觀察：建立大鼠同種異體穿透性角膜移植模型，觀察腹腔注射不同劑量的FTY720對(duì)植片免疫排斥反應(yīng)的影響；并與1％環(huán)孢霉素A(CsA)滴眼比較，評(píng)價(jià)其效果，為將來應(yīng)用于臨床提供有效的給藥方案。 2．機(jī)制探討：(1)角膜移植模型大鼠腹腔注射不同劑量的FTY720后，檢測(cè)其外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量在

7、不同時(shí)間點(diǎn)的變化。(2)在植片急性排斥期，檢測(cè)空白對(duì)照組和使用不同劑量的FTY720組植片的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和白介素-2受體(IL-2R)的表達(dá)。這些結(jié)果可以幫助我們從角膜移植排斥反應(yīng)經(jīng)典免疫途徑對(duì)FTY720的可能作用機(jī)制進(jìn)行探討。研究方法： 1．以SPF級(jí)Wistar大鼠為供體，SD大鼠為受體，建立同種異體穿透性角膜移植模型，隨機(jī)分組(A、B、C、D)共4組，A組：空白對(duì)照組，B組：1％CsA滴眼組，C組：FTY

8、720腹腔注射(0.2mg/kg/d)組，D組：FRY720腹腔注射(0.6mg/kg/d)組，各組從術(shù)后第一天開始用藥，用至第14天停藥。用裂隙燈顯微鏡觀察比較各組角膜植片在術(shù)后12天透明度、水腫度、新生血管度、移植排斥指數(shù)(RI)情況以及植片發(fā)生排斥時(shí)間。 采用SPSS12.0 for window統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，記錄植片的存活時(shí)間，繪制Kaplan-Meier曲線，用Long-rank tes

9、t進(jìn)行比較；術(shù)后12天各組臨床參數(shù)的比較應(yīng)用單項(xiàng)方差分析(One-way ANOVA)法，各組之間比較采用LSD方法，顯著性標(biāo)準(zhǔn)為P≤0.05。 2、以SPF級(jí)Wistar大鼠為供體，SD大鼠為受體，建立同種異體穿透性角膜移植模型，隨機(jī)分組(A、B)共2組，A組：FTY720腹腔注射(0.2mg/kg/d)組，B組：FTY720腹腔注射(0.6mg/kg/d)組，用藥時(shí)間為術(shù)后第1天至14天。各組在術(shù)前、術(shù)后用藥期間及停藥后多個(gè)

10、時(shí)間點(diǎn)對(duì)大鼠剪尾采集外周血，用血細(xì)胞自動(dòng)計(jì)數(shù)儀行淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)。 采用SPSS12.0 for window統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，記錄各時(shí)間點(diǎn)不同組別大鼠的外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量，采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析比較，顯著性標(biāo)準(zhǔn)為P≤0.05。 3、以SPF級(jí)Wistar大鼠為供體，SD大鼠為受體，建立同種異體穿透性角膜移植模型，隨機(jī)分組(A、B、C)共3組，A組：空白對(duì)照組，B組：FTY720腹腔注射(0.2m

11、g/kg/d)，C組：FTY720腹腔注射(0.6mg/kg/d)組，于術(shù)后12天取角膜植片，制作石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察各組角膜植片病理學(xué)改變，免疫組織化學(xué)染色(SABC法)檢測(cè)VEGF及IL-2R在各組角膜組織的表達(dá)及分布情況。采用SPSS12.0 for windows統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用單向方差分析(One-way ANOVA)比較，顯著性標(biāo)準(zhǔn)為P≤0.05。 研究結(jié)果： 1．

12、各組植片平均存活時(shí)間為：空白對(duì)照組(11.123±1.959)d，1％CSA點(diǎn)眼組(16.125±2.532)d，0.2mg/kg腹腔注射FTY720組(35.000±26.490)d，0.6mg/kg腹腔注射FTY720組(46.750±33.148)d。各組生存時(shí)間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X<'2>=53.746，P=0.000)，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P=0.000)。 2．急性排斥期，0.2rag/kg和0.6m

13、g/kg FTY720組的植片新生血管程度均比空白對(duì)照組減輕(分別為P=0.001，P=0.000)；總的抗排斥效果來看(RI)，它們均比環(huán)孢素A點(diǎn)眼組好(分別為P=0.002，P=0.000)。 3．FTY720對(duì)角膜移植模型大鼠外周血淋巴細(xì)胞的影響： (1)腹腔注射FTY720后，外周血淋巴細(xì)胞迅速減少，用藥后5小時(shí)可降至谷底，0.2mg/kg 組降至術(shù)前的35.2％，0.6mg/kg組降為17.4％。

14、(2)在用藥期間兩組的PBL數(shù)量均維持在較低水平。整個(gè)觀察期間B組比A組PBL更低(F=43.536，P=0.000)。 (3)停藥后PBL 數(shù)量回升，0.2mg/kg組在停藥后2周時(shí)升至用藥前水平(P=0.444)0.6mg/kg組在停藥后4周時(shí)升至用藥前水平(P=0.809)。 4．急性排斥期角膜植片的病理及免疫組化檢查： (1)HE染色：空白對(duì)照組植片顯著增厚，大量單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，新生血管形成；全身

15、用FTY720組植片厚度正常，無明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，無新生血管形成。 (2)免疫組化：不同劑量的FTY720組植片VEGF和IL-2R陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量均較空白對(duì)照組減少(P<0.05)。 結(jié)論： 1．FTY720全身用藥可以有效防治角膜移植排斥反應(yīng)，延長(zhǎng)植片存活時(shí)間，且效果較1％環(huán)孢素A點(diǎn)眼更佳，F(xiàn)TY720抑制急性排斥反應(yīng)效果隨用量的增加而加強(qiáng)。2．FTY720毒副作用極少，治療窗寬，可以安全較大劑量使用。