細(xì)胞凋亡在角膜移植免疫排斥反應(yīng)中作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分大鼠角11I移植術(shù)后早期角膜基質(zhì)細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究 目的研究大鼠角膜移植術(shù)后早期角膜植片基質(zhì)細(xì)胞凋亡的發(fā)生規(guī)律。 方法建立SD大鼠(受體)和Wistar大鼠(供體)同種異體穿透性角膜移植模型，SD大鼠自體穿透性角膜移植模型，并以對(duì)側(cè)眼為正常對(duì)照。術(shù)后24h和7d，實(shí)驗(yàn)各組隨機(jī)處死5只動(dòng)物，取術(shù)眼角膜標(biāo)本，TUNEL法檢測(cè)角膜植片周邊區(qū)和中央?yún)^(qū)基質(zhì)層細(xì)胞凋亡情況；透射電鏡觀察凋亡細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變。 結(jié)果1.

2、實(shí)驗(yàn)各組角膜移植術(shù)后基質(zhì)層凋亡細(xì)胞明顯增多，主要存在于基質(zhì)淺層，分布以植片周邊區(qū)為主。2．術(shù)后24h，實(shí)驗(yàn)各組周邊區(qū)與中央?yún)^(qū)的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)較正常對(duì)照組升高(P<0．01)，且周邊區(qū)高于中央?yún)^(qū)(P<0．01)。3．術(shù)后7d，實(shí)驗(yàn)各組周邊區(qū)與中央?yún)^(qū)的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)較術(shù)后24h下降(P

3、無(wú)顯著性(P>0．05)，周邊區(qū)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)差異無(wú)顯著性(P>0．05)。 結(jié)論角膜移植術(shù)后早期出現(xiàn)基質(zhì)細(xì)胞凋亡，主要存在于手術(shù)造成的損傷區(qū)域附近的基質(zhì)淺層，其發(fā)生機(jī)制主要與角膜移植術(shù)后局部創(chuàng)傷修復(fù)有關(guān)。 第二部分Fas／FasL及其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在大鼠角膜移植免疫排斥反應(yīng)中作用的實(shí)驗(yàn)研究 目的研究大鼠角膜移植免疫排斥反應(yīng)過(guò)程中植片上角膜細(xì)胞凋亡的發(fā)生規(guī)律和凋亡調(diào)節(jié)蛋白Fas／FasL表達(dá)的變

4、化規(guī)律，探討兩者的相關(guān)性及在角膜移植免疫排斥反應(yīng)中的作用。 方法建立SD大鼠(受體)和Wistar大鼠(供體)同種異體穿透性角膜移植模型，SD大鼠自體穿透性角膜移植模型，并以對(duì)側(cè)眼為正常對(duì)照。術(shù)后每天顯微鏡觀察術(shù)眼，判斷移植免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生；術(shù)后3d，7d(排斥反應(yīng)發(fā)生前)，10d，14d(急性排斥反應(yīng)期)，21d，28d(排斥反應(yīng)發(fā)生后)，實(shí)驗(yàn)各組隨機(jī)處死動(dòng)物，取術(shù)眼角膜標(biāo)本，TUNEL法檢測(cè)角膜植片上皮層，基質(zhì)層，內(nèi)皮層細(xì)

5、胞凋亡情況；免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)角膜植片F(xiàn)as／FasL蛋白的表達(dá)。 結(jié)果1.術(shù)后實(shí)驗(yàn)各組角膜植片各層均出現(xiàn)凋亡的角膜細(xì)胞；同種異體移植組在急性排斥反應(yīng)期植片各層凋亡細(xì)胞的數(shù)量明顯高于排斥反應(yīng)發(fā)生前和排斥反應(yīng)發(fā)生后(P

6、于排斥前和排斥后(P<0．05)；自體移植組術(shù)后Fas，F(xiàn)asL蛋白的表達(dá)水平逐漸降低。3．實(shí)驗(yàn)各組術(shù)后移植免疫排斥反應(yīng)發(fā)生過(guò)程中Fas，F(xiàn)asL蛋白的表達(dá)水平與角膜植片中細(xì)胞凋亡的發(fā)生情況呈正相關(guān)(P<0．05)。 結(jié)論角膜移植物細(xì)胞凋亡及FasWasL蛋白參與角膜移植急性免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生。 第三部分白細(xì)胞介素-1β對(duì)角膜移植免疫排斥反應(yīng)中細(xì)胞凋亡發(fā)生的影響的實(shí)驗(yàn)研究 目的研究白細(xì)胞介素-1β(IL

7、-1β)在角膜移植免疫排斥反應(yīng)過(guò)程中表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律及白細(xì)胞介素-1拮抗劑(IL-1ra)對(duì)凋亡調(diào)節(jié)蛋白Fas/FasL表達(dá)的影響，探討IL-1β對(duì)于角膜移植免疫排斥反應(yīng)中發(fā)生的細(xì)胞凋亡的影響作用。 方法建立SD大鼠(受體)和Wistar大鼠(供體)同種異體穿透性角膜移植模型，將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為治療I組(50；~LIL一1ra點(diǎn)眼治療)，治療Ⅱ組(100；tLIL—lra點(diǎn)眼治療)，對(duì)照組(生理鹽水點(diǎn)眼)；術(shù)后每天顯微鏡觀察術(shù)

8、眼，判斷移植免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生；實(shí)驗(yàn)各組分別于排斥前，急性排斥期，排斥發(fā)生后隨機(jī)處死動(dòng)物，取其角膜標(biāo)本和房水標(biāo)本；ELISA法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)各組各時(shí)間段IL-1β含量變化；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)各組各時(shí)間段Fas／FasL蛋白的表達(dá)。 結(jié)果1.IL-1rα治療組角膜植片存活時(shí)間比生理鹽水對(duì)照組明顯延長(zhǎng)(P<0．01)，且存在劑量相關(guān)性。2．各實(shí)驗(yàn)組術(shù)后房水中IL-1β含量較正常對(duì)照組明顯升高(P<0．01)；在急性排斥期IL一1B含量

9、達(dá)到高峰，顯著高于排斥前和排斥后(P<0．01)；IL—Ira治療組術(shù)后各時(shí)間段房水中IL-1β含量明顯低于生理鹽水對(duì)照組(P<0．01)。3．各實(shí)驗(yàn)組Fas，F(xiàn)asL蛋白的表達(dá)在急性排斥期程度最高，明顯高于排斥前和排斥后(P<0．01)；在角膜移植排斥反應(yīng)的各時(shí)期，IL-1rα治療組Fas和FasL蛋白的表達(dá)水平均明顯低于生理鹽水對(duì)照組(P<0．05)，且存在劑量相關(guān)性。 結(jié)論1．IL-1β是啟動(dòng)角膜移植排斥反應(yīng)的關(guān)鍵因素之一

10、，參與角膜移植排斥反應(yīng)過(guò)程中FasWasL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的發(fā)生。2．IL一1ra可以減少房水中IL-1β含量，抑制角膜植片中Fas／FasL的表達(dá)，減少移植物細(xì)胞的調(diào)亡，降低角膜移植免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生率，提高植片存活時(shí)間。 第四部分大鼠角膜移植術(shù)后凋亡相關(guān)基因caspase-3mRNA表達(dá)的初步研究 目的研究大鼠角膜移植術(shù)后角膜植片中caspase-3mRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，探討其與術(shù)后植片細(xì)胞凋亡發(fā)生的關(guān)

11、系。 方法建立SD大鼠(受體)和wistar大鼠(供體)同種異體穿透性角膜移植模型，SD大鼠自體穿透性角膜移植模型，并以對(duì)側(cè)眼為正常對(duì)照。術(shù)后每天顯微鏡觀察術(shù)眼，判斷移植免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生；術(shù)后3d，7d(排斥反應(yīng)發(fā)生前)，lOd，14d(急性排斥反應(yīng)期)，21d，28d(排斥反應(yīng)發(fā)生后)，實(shí)驗(yàn)組每組隨機(jī)處死3只動(dòng)物，取其角膜標(biāo)本，采用RT-PCR法檢測(cè)角膜移植術(shù)后不同時(shí)期caspase一3mRNA的表達(dá)。 結(jié)果1.ca

12、spase-3mRNA在正常對(duì)照角膜上無(wú)法檢測(cè)出。2．實(shí)驗(yàn)各組角膜移植術(shù)后早期caspase-3mRNA的表達(dá)即可被檢測(cè)出。3．同種異體移植組急性排斥反應(yīng)期角膜植片caspase-3mRNA的表達(dá)達(dá)到高峰(p