虹膜在角膜移植免疫排斥反應(yīng)中的病理、功能變化及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　研究角膜移植免疫排斥反應(yīng)中虹膜的病理及功能改變，在此基礎(chǔ)上探討前房植入環(huán)孢素A緩釋片（Cyclosporine A drug delivery system，CsA DDS)防治角膜移植免疫排斥反應(yīng)的可能機(jī)制。
　　方法：
　?。?）角膜移植免疫排斥時(shí)虹膜的病理改變
　　建立以BALB/C小鼠為角膜供體及受體的同系移植組，以 C57BL/6J小鼠為角膜供體、BALB/C小鼠為角膜受體的異系移植組，在此

2、基礎(chǔ)上著重對虹膜的病理變化進(jìn)行分析。于術(shù)后2周異系移植組小鼠發(fā)生角膜移植免疫排斥反應(yīng)時(shí)進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：①血管通透性變化檢測：分別采用異硫氰酸熒光素葡聚糖（FITC-Dextran）及伊文思藍(lán)（Evans Blue）為染料行血管造影觀察各組小鼠虹膜血管通透性的變化，并通過房水涂片瑞氏-吉姆薩染色觀察房水中免疫細(xì)胞的浸潤情況；②細(xì)胞因子檢測：通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）比較各組

3、小鼠虹膜內(nèi)主要細(xì)胞因子白細(xì)胞介素1β（Interleukin-1β, IL-1β）、IL-6、IL-12等表達(dá)水平的差異；③免疫細(xì)胞分析：應(yīng)用免疫熒光染色觀察各組小鼠虹膜內(nèi)CD4+T淋巴細(xì)胞的浸潤情況；④NF-κB活性分析：利用免疫熒光技術(shù)檢測虹膜內(nèi)NF-κB活性的變化（主要檢測p65、磷酸化p65的表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)定位）。
　　（2）免疫微環(huán)境改變對虹膜色素上皮細(xì)胞功能的影響及其可能機(jī)制
　　利用小鼠虹膜色素上皮細(xì)胞（Iris

4、 pigment epithelial cells，IPEs）與脾淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)模型，研究IFN-γ模擬的炎性免疫微環(huán)境對IPE細(xì)胞功能的影響。將IPE細(xì)胞分為正常對照組、IFN-γ組、IFN-γ+CsA組、IFN-γ+NF-κB抑制劑（JSH23）組，分別刺激48小時(shí)，收集各組 IPE細(xì)胞與羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（5,6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE）

5、標(biāo)記的脾淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)96h，進(jìn)行以下分析：①通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測各組IPE細(xì)胞對CD4+T細(xì)胞增殖的抑制率；②采用 ELISA檢測各組共培養(yǎng)上清中 IFN-γ和 IL-2的含量；③應(yīng)用Western blot技術(shù)分析IPE細(xì)胞中NF-κB活性的變化。
　?。?）前房植入CsA DDS對虹膜的影響及其抑制角膜移植免疫排斥反應(yīng)的可能機(jī)制
　　利用縫線法誘導(dǎo)兔角膜新生血管并在新生血管化的植床上行穿透性角膜移植，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為

6、對照組及 CsA DDS組，其中對照組術(shù)后未予藥物干預(yù)，CsADDS組在行角膜移植術(shù)時(shí)前房植入CsA DDS。術(shù)后觀察角膜植片的變化情況并著重分析虹膜的病理改變，行如下實(shí)驗(yàn)：①臨床觀察：利用裂隙燈顯微鏡評估角膜植片的排斥情況并繪制角膜生存曲線，通過激光共聚焦顯微鏡（in vivo laser scanning confocal microscopy）和眼前節(jié)光學(xué)相干斷層成像（anterior segment optical cohere

7、nce tomography，AS-OCT）等檢查評估前房植入CsA DDS防治角膜移植免疫排斥反應(yīng)的效果；②虹膜及房水病理改變：借助虹膜蘇木素-伊紅染色、房水涂片瑞氏-吉姆薩染色觀察前房植入CsA DDS對虹膜及房水的影響；③虹膜中細(xì)胞因子檢測：應(yīng)用qRT-PCR比較各組虹膜中細(xì)胞因子和共刺激分子的表達(dá)水平差異；④房水中細(xì)胞因子測定：采用ELISA技術(shù)檢測房水中IL-2的含量；⑤虹膜中免疫細(xì)胞分析：利用免疫熒光技術(shù)比較各組虹膜中CD4

8、+T淋巴細(xì)胞的浸潤情況；⑥虹膜內(nèi)NF-κB活性分析：通過免疫熒光技術(shù)比較各組虹膜中NF-κB的活性變化（主要檢測p65的表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)定位）。
　　結(jié)果：
　　（1）角膜移植免疫排斥時(shí)虹膜內(nèi)的炎癥反應(yīng)增強(qiáng)
　　與同系移植組相比，異系移植組小鼠虹膜內(nèi)血管管腔明顯擴(kuò)大，血管的滲漏性顯著增強(qiáng)；虹膜和角膜中IL-1β、IL-6、IL-12、IL-15的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)、并出現(xiàn)大量CD4+T淋巴細(xì)胞的浸潤；虹膜和角膜中p6

9、5及磷酸化p65的表達(dá)水平均明顯增強(qiáng)，且主要定位于細(xì)胞核，提示角膜移植免疫排斥過程中虹膜及角膜中的NF-κB處于活化狀態(tài)。
　?。?）NF-κB活性增強(qiáng)導(dǎo)致IPE細(xì)胞免疫抑制功能下降
　　在IFN-γ模擬的炎性免疫微環(huán)境下，IPE細(xì)胞抑制CD4+T細(xì)胞增殖的能力明顯降低，其共培養(yǎng)上清中IL-2及IFN-γ的含量顯著增加；而CsA可顯著增強(qiáng)IPE細(xì)胞對CD4+T細(xì)胞增殖的抑制作用（P＜0.01），并有效減少共培養(yǎng)上清中IL-2

10、及IFN-γ的含量（P＜0.01）。此外，在IFN-γ刺激下IPE細(xì)胞的NF-κB活性顯著增強(qiáng)（主要表現(xiàn)為p65的磷酸化水平明顯增加），而CsA則可明顯抑制IPE細(xì)胞的NF-κB活性（主要表現(xiàn)為p65磷酸化水平顯著下降）；同時(shí)利用小分子化合物JSH23抑制NF-κB也能增強(qiáng) IPE細(xì)胞的免疫抑制功能，提示 CsA可通過抑制 NF-κB的活性改善 IPE細(xì)胞的免疫抑制功能。
　?。?）前房植入CsA DDS可有效減輕虹膜內(nèi)的炎癥反應(yīng)

11、
　　與對照組相比，前房植入CsA DDS除可以顯著抑制角膜內(nèi)的免疫反應(yīng)外，還可以顯著改善虹膜及房水的病理變化：前房植入CsA DDS可明顯抑制虹膜內(nèi)的血管擴(kuò)張并減少房水中免疫細(xì)胞的浸潤，降低虹膜中IFN-γ、IL-2、IL-6及共刺激分子CD80、CD86的表達(dá)水平，抑制房水內(nèi)IL-2的表達(dá)水平（P＜0.01），減少虹膜內(nèi)CD4+T淋巴細(xì)胞的浸潤。此外，CsA DDS組虹膜中p65的表達(dá)水平及其細(xì)胞核定位也較對照組明顯減少，提示

12、CsA DDS對上述病理變化的改善作用可能與NF-κB活性降低有關(guān)。
　　結(jié)論：
　　（1）角膜移植免疫排斥過程中，虹膜內(nèi)炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，NF-κB異常活化。
　?。?）在IFN-γ模擬的炎性免疫微環(huán)境下，IPE細(xì)胞NF-κB的活性增強(qiáng)導(dǎo)致其免疫抑制功能下降，而CsA可通過抑制NF-κB的活性顯著改善IPE細(xì)胞的免疫抑制功能。
　　（3）前房植入CsA DDS除抑制角膜內(nèi)的免疫反應(yīng)外，還可通過抑制虹膜內(nèi)的炎癥反應(yīng)有