DC在高危角膜移植排斥反應(yīng)中免疫調(diào)節(jié)機制的實驗研究.pdf

1、目的:培養(yǎng)和誘導(dǎo)大鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞(dendriticcell,DC),研究未成熟樹突狀細(xì)胞(immaturedendriticcell,imDC)對高危角膜移植免疫排斥反應(yīng)的抑制作用,探討imDC誘導(dǎo)免疫耐受的機制。
　　方法:聯(lián)合應(yīng)用重組大鼠粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor,GM-CSF)和白細(xì)胞介素(Interleukin,IL)-

2、4培養(yǎng)、誘導(dǎo)、擴增大量的imDC,腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactor,TNF-α)誘導(dǎo)其成為成熟樹突狀細(xì)胞(maturedendriticcell,mDC),結(jié)合形態(tài)學(xué)、細(xì)胞表面標(biāo)志加以鑒定;以60只SD大鼠為受體,30只Wistar大鼠為供體,堿燒傷建立同種異體高危角膜移植模型。受體SD大鼠隨機分為對照組、imDC組和mDC組,每組20只;對照組:術(shù)前7d經(jīng)尾靜脈注射PBS液0.1ml;imDC組和mDC組分別于

3、術(shù)前7d經(jīng)尾靜脈注射體外培養(yǎng)的供體骨髓來源的imDC和mDC1×106個。術(shù)后每日裂隙燈下觀察各組角膜植片存活情況并評分;于術(shù)后3d、7d、14d三個時間點,每組隨機處死4只受體大鼠,取角膜植片行HE染色;逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測角膜植片Th1型細(xì)胞因子(IL-12、IL-15、IL-18)和Th2型細(xì)胞因子(IL-4、IL-10)mRNA表達水平;蛋白印跡法(Westernblot)分析檢測各組大鼠脾臟CD4+CD

4、25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表面特異性標(biāo)志轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達。
　　結(jié)果:通過聯(lián)合應(yīng)用重組大鼠GM-CSF、IL-4、TNF-α三種細(xì)胞因子,培養(yǎng)、誘導(dǎo)、擴增大量的DC,經(jīng)倒置相差顯微鏡、掃射電鏡的形態(tài)學(xué)觀察、流式細(xì)胞儀進行免疫學(xué)表型檢測,可證實為不同成熟狀態(tài)下的DC。角膜移植術(shù)后,觀察角膜植片存活時間,imDC組植片存活時間與對照組、mDC組比較顯著延長,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05);RT-PCR檢測:imDC組Th1型細(xì)

5、胞因子IL-12、IL-15、IL-18mRNA表達較對照組和mDC組明顯降低;Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-10mRNA表達明顯升高;Westernblot檢測:各時間點Foxp3表達的相對吸光度值imDC組均明顯高于對照組和mDC組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)。
　　結(jié)論:通過聯(lián)合應(yīng)用重組大鼠GM-CSF、IL-4、TNF-α三種細(xì)胞因子能培養(yǎng)、誘導(dǎo)、擴增出大量的DC;輸注體外培養(yǎng)的供體骨髓來源的imDC可以誘導(dǎo)角