RNA干擾CⅡTA控制大鼠肝移植急性排斥反應的實驗研究.pdf

1、本實驗構建針對大鼠Ⅱ類主要組織相容性復合物反式轉錄激活因子 (classⅡ major histocompability complex transactivator，CⅡTA)基因的短發(fā)夾狀RNA(small hairpin RNA，shRNA) 質粒載體，通過體外轉染大鼠骨髓源樹突狀細胞(dendritic cell，DC)和體內轉染脾臟的方法，研究RNA干擾C ⅡTA對于Ⅱ類主要組織相容性復合物(class Ⅱ major his

2、tocompability complex，MHc-Ⅱ)基因表達的抑制效果，并篩選相對高效 shRNA 質粒；采用經門靜脈注射質粒載體的方法體內轉染肝臟研究基因轉染效果；建立穩(wěn)定的高應答大鼠原位肝移植模型，采用門靜脈注射質粒載體方法干預供體，獲得免疫原性減低的移植物用于肝移植，研究RNA干擾CⅡTA在高應答大鼠原位肝移植模型中控制移植排斥反應的作用并探討其機制。 第一部分 CⅡTA-shRNA 質粒載體構建及體外研究 目

3、的：構建針對大鼠CⅡTA基因的shRNA質粒載體，探討體外RNA干擾CⅡTA 的抑制效果和對于MHC-Ⅱ基因表達的調控作用，并篩選相對高效shRNA質粒。 方法：體外培養(yǎng)大鼠骨髓源 DC，構建針對大鼠 C ⅡTA 基因的三個shRNA質粒載體，設置空白對照組、HK-shRNA 陰性質粒對照組、轉染劑 Lipofectamine組和三個 CⅡTA-shRNA 質粒干預組，分別轉染DC，以熒光實時定量PCR和流式細胞術檢測DC轉染后

4、CⅡTA 和 MHCⅡ的表達變化。 結果：大鼠骨髓源 DC培養(yǎng)成功，CⅡTA-shRNA 質粒載體構建成功：與空白對照組、HK-shRNA 陰性質粒對照組和Lipofectamine組相比，三個CⅡTA-shRNA 質粒干預組DC轉染后的CⅡTA和MHC-Ⅱ的mRNA轉錄水平及MHC-Ⅱ抗原表達水平均顯著性減低(P<0.01)，CⅡTA與MHC-Ⅱ基因表達具有明顯正相關；pCⅡTA1-shRNA干預組對目的基因表達抑制最為明顯，

5、CⅡTAmRNA 轉錄水平為 10.75±3.31％，MHC-ⅡmRNA 轉錄水平為15.25±5.73％，MHC-Ⅱ抗原表達水平為25.01±5.16％。 結論：應用成功構建的CⅡTA-shRNA 質粒載體轉染大鼠骨髓源 Dc，可顯著抑制 DC 的CⅡTA 和 MHC-Ⅱ基因表達；CⅡTA 與 MHC-Ⅱ的基因表達具有明顯正相關，說明 CⅡTA嚴格調控 MHC-Ⅱ表達，RNA 干擾 CⅡTA可明顯抑制MHC-Ⅱ基因表達：pCⅡ

6、TA1-shRNA為相對高效的 shRNA 質粒，可進一步應用于體內實驗和動物實驗。 第二部分經門靜脈注射質粒載體的體內研究 目的：評價經門靜脈注射質粒載體方法體內轉染肝臟的轉染效果，探討體內RNA 干擾 CⅡTA 的抑制效果和對于 MHC-Ⅱ基因表達的調控作用，并篩選相對高效shRNA質粒。 方法：設置生理鹽水對照組和質粒載體組，經門靜脈注射方法體內干預大鼠肝臟，采取轉染后第一天和第三天肝臟標本，應用全波長酶標

7、儀檢測和熒光顯微鏡觀察的方法評價體內肝臟轉染效果；設置生理鹽水對照組、HK-shRNA 陰性質粒對照組和三個CⅡTA-shRNA 質粒干預組，通過經門靜脈注射方法體內干預大鼠脾臟，轉染3天后取脾臟標本，以熒光實時定量PCR和流式細胞術檢測脾臟轉染后 CⅡTA 和 MHC-Ⅱ的表達變化。 結果：第一天和第三天質粒載體組的增強型綠熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)熒光強度均顯著

8、強于鹽水對照組(P<0.01)，質粒載體組第三天熒光強度強于第一天(P<0.01)；與鹽水對照組和HK-shRNA陰性質粒對照組相比，三個CⅡTA-shRNA 質粒干預組脾臟轉染后的CⅡTA 和MHC-Ⅱ的mRNA 轉錄水平及 MHC-Ⅱ的抗原表達水平均顯著性減低(P<0.01)，CⅡTA與MHC-Ⅱ基因表達具有明顯正相關；pCⅡTA1-shRNA干預組對目的基因表達抑制最為明顯，CⅡTA mRNA 轉錄水平為 9.244-1.12％，

9、MHC-Ⅱ mRNA轉錄水平為17.81±3.61％，MHC-Ⅱ抗原表達水平為23.874-5.45％。 結論：經門靜脈注射質粒載體方法可使shRNA質粒在體內肝臟獲得高效轉染；應用成功構建的CIIFA-shRNA 質粒載體體內轉染大鼠脾臟，可顯著抑制脾臟的CⅡTA和MHC-Ⅱ基因表達，CⅡTA與MHC-Ⅱ基因表達具有明顯正相關，說明CⅡTA嚴格調控MHC-Ⅱ表達，在體內采用RNA干擾技術抑制CⅡTA可明顯抑制MHC-Ⅱ基因表達

10、；pCⅡTA1-shRNA為相對高效的shRNA質粒，可進一步應用于動物實驗。 第三部分 RNA干擾CⅡTA 在高應答大鼠原位肝移植模型中的實驗研究 目的：觀察經門靜脈注射CⅡTA-shRNA質粒方法干預供體移植物對高應答大鼠原位肝移植模型中移植排斥反應的影響，探討其抗排斥機制。 方法；建立高應答大鼠原位肝移植模型；采用經門靜脈注射pCⅡTA1-shRNA 方法干預供體大鼠肝臟，干預后3天取移植物進行肝移植，同時

11、設置鹽水對照組、HK-shRNA 陰性質粒對照組和環(huán)孢素A治療組，每組各12只大鼠，于移植術后第4天隨機選取6只大鼠取出移植肝臟，病理學檢查評定排斥反應分級，熒光實時定量PCR方法檢測標本中CⅡTA、MHC-Ⅱ、IL-2和IFN-γ的mRNA轉錄水平變化，免疫組化方法檢測MHC-Ⅱ抗原表達變化，其余6只用于觀察存活期。 結果：穩(wěn)定建立高應答大鼠原位肝移植模型；與鹽水對照組和HK-shRNA陰性質粒對照組相比，CⅡTA1-shRN

12、A 質粒干預組大鼠存活時間明顯延長(中位生存期8天vs5天和5天，P<0.01)，排斥反應病理分級明顯降低(P<0.01)，CⅡTA、MHC-Ⅱ、IL-2和IFN-γ的mRNA 轉錄水平均明顯降低(P<0.01)，MHC-Ⅱ抗原表達水平明顯降低 (P<0.01)。環(huán)孢素A治療組大鼠均獲得了長期存活(超過100天)。 結論：高應答大鼠原位肝移植模型是研究肝移植排斥反應的理想動物模型；CⅡTA與MHC-Ⅱ基因的表達與肝移植排斥反應病