大鼠肝移植急性排斥模型的建立及一些相關(guān)研究.pdf

1、雖然高效免疫抑制劑的應(yīng)用明顯提高了肝移植患者生存率,但急性排斥反應(yīng)(Acute Rejection,AR)仍然是肝移植術(shù)后最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,其發(fā)生率仍然高達(dá)40％～60％,因此急性排斥仍然是肝移植研究的重點(diǎn)之一。急性排斥是由受體效應(yīng)細(xì)胞對(duì)供體的同種異體抗原識(shí)別后而產(chǎn)生的一個(gè)免疫過(guò)程,在此過(guò)程中同種異體抗原通過(guò)抗原呈遞細(xì)胞的MHC-II類分子呈遞給效應(yīng)細(xì)胞,隨者各種細(xì)胞因子分泌受體免疫系統(tǒng)激活。傳統(tǒng)研究認(rèn)為,Th1/Th2動(dòng)態(tài)平衡和AR

2、的預(yù)后相關(guān),在肝移植和腎移植中Th1功能激活在AR發(fā)生前就被觀察到,Th2細(xì)胞則被證實(shí)與移植物耐受相關(guān)。然而最近,隨著一個(gè)新的細(xì)胞系Th17的發(fā)現(xiàn)及對(duì)iTreg細(xì)胞免疫作用研究的日益深入,Th17/iTreg平衡已成為T(mén)h1/Th2平衡在移植免疫中的作用的一個(gè)重要補(bǔ)充,然而迄今Th17和iTreg在移植免疫中的作用尚未完全闡明。新興的蛋白組學(xué),是對(duì)基因組所編碼的所有蛋白質(zhì)進(jìn)行研究的學(xué)科。通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)使我們對(duì)肝移植急性排斥的發(fā)生、發(fā)展有

3、了更詳盡的理解,并能夠通過(guò)發(fā)現(xiàn)特異的分子標(biāo)志物來(lái)預(yù)測(cè)患者預(yù)后和治療效果?；|(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(matrixassisted laserdesorption,time of flight/time of flight,mass spectrometry,MALDI-TOF/TOF MS)和LTQ是蛋白質(zhì)組學(xué)新興運(yùn)用的技術(shù),已有眾多的研究組利用該技術(shù)在患者體液中發(fā)現(xiàn)了能夠早期診斷疾病的標(biāo)志物;本課題研究希望通過(guò)研究在肝移植

4、術(shù)后大鼠血清中尋找與急性排斥相關(guān)的分子標(biāo)記物,并對(duì)具有潛在價(jià)值的標(biāo)記進(jìn)行調(diào)控。本研究分為三個(gè)部分：
　　 第一部分：LEWIS→BN大鼠肝移植急性排斥模型的建立。
　　 目的：建立近交系LEWIS→BN大鼠原位肝移植急性排斥模型,分析手術(shù)成功率的影響因素及該模型的穩(wěn)定性,并總結(jié)該模型區(qū)別于常規(guī)使用的SD、Wistar等封閉群大鼠間原位肝移植的特點(diǎn)
　　 結(jié)果：⑴LEW→BN及BN→BN總共29對(duì)大鼠OLT成功率為

5、74％,手術(shù)失敗原因構(gòu)成:肝上下腔靜脈出血(4對(duì));門(mén)靜脈結(jié)構(gòu)性錯(cuò)誤(3對(duì));急性肺部損傷,可能與乙醚過(guò)度吸入有關(guān)(2對(duì));尸體解剖未發(fā)現(xiàn)明顯死亡原因(1對(duì))。⑵供受體體重差異對(duì)手術(shù)的影響可通過(guò)控制體重及調(diào)整手術(shù)技術(shù)改善,抗生素對(duì)術(shù)后生存有明顯影響。⑶與封閉群大鼠肝移植比較,該模型具有自身特點(diǎn)即在排斥出現(xiàn)的時(shí)間、程度和結(jié)果轉(zhuǎn)歸上表現(xiàn)并非完全一致,然而所有受體均出現(xiàn)了排斥現(xiàn)象。
　　 第二部分：T-bet+、GATA-3+、ROR

6、γt+和FOXP3+細(xì)胞在大鼠肝移植術(shù)后動(dòng)態(tài)變化的研究。
　　 目的：評(píng)估Th1,Th2,Th17和iTreg在肝移植急性排斥中的作用,我們使用近交系LEWIS大鼠做供體,BN大鼠做受體建立肝移植急性排斥模型,并應(yīng)用Banff標(biāo)準(zhǔn)對(duì)AR急性分級(jí),然后應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)Th1,Th2,Th17和iTreg特征性表達(dá)的核轉(zhuǎn)錄因子以評(píng)估相應(yīng)的作用。
　　 結(jié)果：⑴BN→BN組未出現(xiàn)明顯排斥現(xiàn)象,LEW→BN組出現(xiàn)不同程度

7、的排斥,對(duì)照組、輕度排斥組、中度排斥組和重度排斥組各選取5例進(jìn)行T-bet+、GATA-3+、RORγt+和FOXP3+細(xì)胞檢測(cè)。⑵T-bet+、GATA-3+、RORγt+和FOXP3+細(xì)胞在同種異體移植物中的表達(dá):與對(duì)照組相比,輕度排斥組、中度排斥組和重度排斥組中T-bet+細(xì)胞數(shù)和RORγt+細(xì)胞數(shù)顯著升高(P值均＜0.009,雙側(cè));輕度排斥組中GATA-3+細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯升高(P值=0.754,雙側(cè)),中度排斥組中明顯升高(P值

8、=0.028,雙側(cè)),重度排斥組顯著升高(P值=0.009,雙側(cè));輕度排斥組FOXP3+細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯升高(P值=0.347,雙側(cè)),中度、重度排斥組顯著升高(P值均＜0.009,雙側(cè))。⑶T-bet+、GATA-3+、RORγt+和FOXP3+細(xì)胞在受體脾臟中的表達(dá)。
　　 第三部分：大鼠肝移植急性排斥血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究。
　　 目的：篩選大鼠肝移植術(shù)后與急性排斥相關(guān)的血清差異蛋白,為進(jìn)一步尋找與預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)記物提

9、供研究基礎(chǔ)。并對(duì)有意義的靶蛋白進(jìn)行干預(yù),觀察干預(yù)對(duì)大鼠肝移植急性排斥的影響。
　　 結(jié)果：⑴應(yīng)用2D-DIGE技術(shù)發(fā)現(xiàn),在對(duì)照組、輕度排斥組、中度排斥組和重度排斥組中,有35個(gè)生物標(biāo)記表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。⑵MALDI-TOF-TOF MS對(duì)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的30個(gè)蛋白進(jìn)行鑒定,16個(gè)點(diǎn)鑒定出,剩余14個(gè)點(diǎn)使用LTQ鑒定出:血液結(jié)合素(hemopexin,HPX)結(jié)合珠蛋白(haptoglobin,Hp)的前體Pr

10、eprohaptoglobin、C3補(bǔ)體、C4補(bǔ)體、Alpha1-Macroglobul in Receptor Binding Domain、Mbll Mannose-binding protein等。⑶對(duì)篩選出的生物標(biāo)記進(jìn)行調(diào)控,觀察其生物效應(yīng)。
　　 結(jié)論：①LEW→BN組合大鼠肝移植是研究急性排斥的穩(wěn)定模型。②T-bet+、GATA-3+、RORγt+和FOXP3+在大鼠肝移植急性排斥中起到重要作用。③篩選出的了一批可能