豬Sox6的基因克隆、原核表達及其在調控肌纖維類型轉化中的作用.pdf

1、由于傳統(tǒng)的飲食習慣，豬肉成為世界消費量最大的肉產品。隨著國家經濟的發(fā)展，人們的生活水平越來越高，消費者對豬肉品質的要求也越來越高。而豬肉品質與肌纖維類型密切相關。根據肌球蛋白（MyHC）亞型，肌纖維可分為Ⅰ、Ⅱa、Ⅱx和Ⅱb型，分別以表達MyHCⅠ、MyHCⅡa、MyHCⅡx和MyHCⅡb為主。提高Ⅰ型肌纖維在肌肉中的比例可有效地改善豬肉品質。Sox6是轉錄因子Sox基因家族的重要成員，參與肌纖維類型轉化的調節(jié)，影響肌肉中Ⅰ型肌纖維的比

2、例。因此，Sox6在豬肉品質調控方面有潛在的應用。但有關豬Sox6的研究目前在國內外尚未見報道。本研究旨在克隆豬Sox6基因，構建豬Sox6原核和真核表達載體，制備重組豬Sox6蛋白，考察過表達豬Sox6和外源添加重組豬Sox6蛋白對肌纖維類型轉化的影響。主要研究內容及結果如下:
　　試驗一 豬Sox6基因編碼區(qū)全序列克隆及組織表達規(guī)律分析
　　Sox6屬于轉錄因子Sox基因家族的一員，參與肌纖維類型轉化的調節(jié)，是慢肌特異基

3、因的抑制子，影響肌肉中Ⅰ型肌紓維的含量。但豬Sox6基因序列目前尚不清楚。為此，本研究以3日齡DLY（Duroc×Landrace×Yorkshire）仔豬為試驗材料，取500mg背最長肌用于總RNA提取并反轉錄成cDNA。根據已知的小鼠、大鼠和人的Sox6編碼區(qū)序列，設計一對簡并引物用于擴增豬Sox6基因目的片段。DNA測序結果顯示，豬Sox6基因編碼區(qū)全序列大小為2406bp，編碼801個氨基酸。將該序列提交至GenBank，獲得的

4、序列登錄號為KF933861。序列分析結果表明，豬Sox6基因核苷酸序列與已知的人、小鼠、大鼠和牛的Sox6基因核苷酸序列同源性分別為87.7％、86.71％、90.91％、89.49％。序列分析結果同時表明，豬Sox6蛋白的氨基酸序列與已知的人、小鼠、大鼠和牛的Sox6蛋白的氨基酸序列同源性分別為89.9％、90.74％、95.26％、90.53％，含有Sox6蛋白保守（100％同源）的HMG box、N端和C端的Q-box、亮氨酸拉

5、鏈結構，暗示豬Sox6可能具有與已報道的其他物種Sox6相類似的功能。接下來，以10周齡DLY豬（母）為研究對象，采用實時熒光定量PCR檢測豬Sox6基因在心、肝、腎、脂肪、背最長肌、趾長伸肌、比目魚肌、腰大肌、脛骨前肌組織中的表達水平。結果表明，豬Sox6 mRNA在豬心臟和骨骼肌中表達最豐富，在腎臟、脂肪、肝臟、脾臟和肺組織中也可檢測到，且在不同類型骨骼肌組織中存在表達差異（背最長肌＞趾長伸?。颈饶眶~肌）。
　　試驗二 豬So

6、x6基因在大腸桿菌中的表達和純化
　　以pET-30a(+)為載體，成功構建了用于表達C端融合6×His-Tag的重組豬Sox6的原核表達載體pET-30a(+)-pSox6。以大腸桿菌Rosetta(DE3)為宿主菌，實現了豬Sox6基因的表達，目的蛋白分子量約為90 kDa。為獲得最佳蛋白表達條件，分別設置了0mmol/L、0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、0.75 mmol/L、1.0 mmol/L、2.0 mm

7、ol/L、3.0 mmol/LIPTG誘導濃度和分別設置了1h、3h、4h、5h、6h、8h表達時間點，SDS-PAGE結果表明，重組蛋白最佳表達條件為在30℃下用1mM IPTG誘導表達5h。溶解性分析結果表明，重組蛋白以可溶性方式存在。表達產物采用親和層析法進行純化，最終重組蛋白濃度約為5μg/mL。對純化后的重組蛋白進行Western blot和蛋白質串聯(lián)質譜(MALDI-TOF/TOF)鑒定，結果表明，純化的重組蛋白為豬Sox6

8、蛋白。
　　試驗三 豬Sox6在調控肌纖維類型轉化中的作用
　　在成功構建重組真核表達載體pcDNA3.1(+)-pSox6、獲得重組豬Sox6蛋白和分離原代豬骨骼肌衛(wèi)星細胞的基礎上，本研究考察了豬Sox6對肌纖維類型轉化的影響。首先，采用肌肉注射方法將pcDNA3.1(+)-pSox6質粒注射到小鼠脛骨前肌中，在動物水平探討過表達豬Sox6對MyHC各亞型表達的影響。實時熒光定量PCR結果表明，過表達豬Sox6顯著下調了M

9、yHCⅠmRNA的表達，同時顯著上調了MyHCⅡa、MyHCⅡx和MyHCⅡbmRNA的表達。Western Blot結果表明，過表達豬Sox6下調了MyHCⅠ蛋白的表達，同時上調了MyHCⅡb蛋白的表達。其次，以C2C12細胞為對象，從體外水平探討了過表達豬Sox6對MyHCⅠ和MyHCⅡb蛋白表達的影響，結果表明，過表達豬Sox6下調了C2C12細胞中MyHCⅠ蛋白的表達，同時上調了C2C12細胞中MyHCⅡb蛋白的表達。最后，在體

10、外水平探討了外源添加重組豬Sox6蛋白對原代豬骨骼肌衛(wèi)星細胞中慢肌纖維相關基因表達的影響，結果表明，外源添加重組豬Sox6蛋白顯著下調了豬骨骼肌衛(wèi)星細胞中MyHCⅠ、Tnnt1、Tnnc1、Tnni1 mRNA的表達。上述結果表明，豬Sox6在調控肌纖維類型轉化中發(fā)揮了重要的作用。
　　總之，本研究成功克隆了豬Sox6基因編碼區(qū)全序列并發(fā)現其主要表達于豬心臟和骨骼肌中，首次用大腸桿菌表達系統(tǒng)、親和層析純化以及稀釋復性的方法獲得了具