超表達(dá)豬源PGC-1α促進(jìn)小鼠和豬肌纖維類型轉(zhuǎn)變的研究.pdf

1、多年來對豬選擇培育的一個重要目標(biāo)是提高生長速度和瘦肉率，并已在遺傳上改良取得了一定的進(jìn)展。瘦肉豬的選育使豬肉中酵解型纖維比例增加、肌纖維直徑增大、豬肉的嫩度、多汁性、風(fēng)味，肉色、肌內(nèi)脂肪和pH值等肉質(zhì)因素均受到嚴(yán)重影響。
　　研究發(fā)現(xiàn)Ⅰ型纖維與肌內(nèi)脂肪含量，肌肉的嫩度呈正相關(guān);而與纖維直徑，pH45MIN，滴水損失呈負(fù)相關(guān)。Ⅱ B纖維橫切面積大，導(dǎo)致豬肉系水力和剪切力的降低，ⅡB纖維中含有大量的酵解酶，在屠宰后45分鐘，肌肉中乳酸

2、和糖原升高，肌肉pH下降，肉色灰白，且系水力低下，滴水損失也與Ⅱ B型纖維正相關(guān)。
　　PGC-1α是細(xì)胞能量代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子，參與調(diào)控線粒體的生成，調(diào)控線粒體的融合和分裂。小鼠實(shí)驗(yàn)顯示，骨骼肌中超表達(dá)PGC-1α?xí)碳ぞ€粒體的生成，并能促進(jìn)骨骼肌中ⅡB纖維向Ⅰ型的轉(zhuǎn)變，增加氧化型纖維的比例。
　　因此，本研究以PGC-1α為候選基因，構(gòu)建肌肉特異性真核表達(dá)載體，在構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠模型的基礎(chǔ)上，制備轉(zhuǎn)PGC-1α基因的大白豬

3、，研究PGC-1α對豬肌肉中能量代謝，肌肉類型轉(zhuǎn)變，以及豬肉肉質(zhì)的影響。取得的主要成果如下:
　　1.以真核表達(dá)載體pEGFP-N1為基礎(chǔ)，豬BAC文庫同源重組的7kb MCK啟動子為驅(qū)動，2.4kb的PGC-1α CDS為表達(dá)序列，構(gòu)建了真核表達(dá)載p-sMCK-sPGC-1α。
　　2.通過原核顯微注射質(zhì)粒p-sMCK-sPGC-1α，獲得轉(zhuǎn)基因陽性小鼠4只并增殖后代。在RNA和蛋白水平，分析了超表達(dá)sPGC-1α對小鼠肌

4、肉造成的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，豬源PGC-1α同樣會促進(jìn)小鼠線粒體生成，并刺激小鼠白肌纖維轉(zhuǎn)變?yōu)榧t肌纖維，增加肌肉的氧化性，另外sPGC-1α也會調(diào)控PDK4的表達(dá)，從而影響小鼠的糖代謝和脂肪代謝。
　　3.以30日齡豬胚胎成纖維細(xì)胞為材料，p-sMCK-sPGC-1α質(zhì)粒轉(zhuǎn)染并篩選獲得了穩(wěn)定表達(dá)sPGC-1α的單克隆.
　　4.通過體細(xì)胞核移植，制備了53頭轉(zhuǎn)基因陽性豬，進(jìn)行鑒定并繁殖。分析了載體在原代轉(zhuǎn)基因豬中的整合位點(diǎn)和拷貝

5、數(shù)，發(fā)現(xiàn)載體的整合位點(diǎn)大多位于X染色體上，并且拷貝數(shù)較多，平均大于20;從豬肌肉的外觀形態(tài)，RNA表達(dá)水平，ATP酶活性，分析了超表達(dá)sPGC-1α肌肉造成的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)， PGC-1α促進(jìn)豬肌肉中線粒體生成，并刺激白肌纖維為紅肌的轉(zhuǎn)變，增加肌肉的氧化性;sPGC-1α也調(diào)控PDK4的表達(dá)，影響豬肌肉中糖代謝和脂肪代謝;另外，通過肉質(zhì)測定發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因豬肉質(zhì)的多項(xiàng)相關(guān)指標(biāo)有明顯改善，例如大理石紋，滴水損失，失水率，系水力，肌內(nèi)脂肪，嫩度