幽門螺桿菌感應(yīng)蛋白CrdS的原核表達(dá)及其在酸適應(yīng)調(diào)控中的作用.pdf

1、目的:原核表達(dá)并純化幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)CrdRS信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)中的感應(yīng)蛋白CrdS，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，通過(guò)體外酸環(huán)境培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，探討其在H.pylori酸適應(yīng)調(diào)控中的作用。
　　方法:提取H.pylori26695標(biāo)準(zhǔn)株全基因組DNA，以此為模版，PCR擴(kuò)增編碼CrdS蛋白的基因hp1364;構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒pUCm-T-hp1364和原核表達(dá)質(zhì)粒pQE30-hp1364，經(jīng)PC

2、R、雙酶切和測(cè)序鑒定后，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌XL1blue，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目標(biāo)蛋白;通過(guò)SDS-PAGE分析，Western blot鑒定表達(dá)蛋白，并對(duì)CrdS蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析。用純化后的重組蛋白CrdS免疫家兔獲得其免疫血清。通過(guò)體外在不同pH值的培養(yǎng)基中加入含抗CrdS的免疫血清培養(yǎng)H.pylori實(shí)驗(yàn)，初步探討CrdS在H.pylori酸適應(yīng)調(diào)控中的作用。
　　結(jié)果:以提取的H.pylori基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增h

3、p1364基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，可見(jiàn)在1200bp處有一明顯條帶，與hp1364基因的分子量大小相符。重組克隆質(zhì)粒pUCm-T-hp1364和原核表達(dá)質(zhì)粒pQE30-hp1364經(jīng)BamHⅠ/HindⅢ雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳分析可見(jiàn)約1200bp處有明顯條帶;測(cè)序后，經(jīng)NCBI BLAST在線比對(duì)所測(cè)序列與hp1364基因序列完全相符。誘導(dǎo)表達(dá)的目標(biāo)蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析，相對(duì)分子量約為46kDa，主要以包涵體形式存

4、在。Western blot鑒定表明表達(dá)蛋白確為目標(biāo)蛋白。生物信息學(xué)分析CrdS的核酸和氨基酸序列與其它H.pylori菌株比較具有極高的同源性，表面有許多親水性區(qū)域，含有多種容易被磷酸化的氨基酸。免疫家兔后獲得該重組蛋白的免疫血清，H.pylori酸環(huán)境培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明CrdS能夠影響H.pylori的生長(zhǎng)。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建了重組克隆質(zhì)粒pUCm-T-hp1364和原核表達(dá)質(zhì)粒pQE30-hp1364，原核表達(dá)了H.pylori