原核表達(dá)幽門(mén)螺桿菌中性粒細(xì)胞激活蛋白及其對(duì)小鼠哮喘的預(yù)防研究.pdf

1、目的：本研究旨在構(gòu)建中性粒細(xì)胞激活蛋白原核表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)原核表達(dá)獲得純化重組幽門(mén)螺桿菌中性粒細(xì)胞激活蛋白；以卵清蛋白（OVA）誘導(dǎo)小鼠建立哮喘動(dòng)物模型；并使用重組HP-NAP(rNAP)對(duì)模型小鼠進(jìn)行干預(yù)，探索重組HP-NAP在哮喘防治方面的作用及機(jī)制。
　　方法：目的基因的擴(kuò)增、克隆及序列分析——取幽門(mén)螺桿菌臨床兒童分離株GZCH1全基因組DNA為模板，用根據(jù)GenBankHPSS1NAP（AF227072）序列設(shè)計(jì)的特異性引物

2、NAP/P1、P2，通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增NAP基因，PCR產(chǎn)物純化后將其克隆入原核表達(dá)載體pET-28a(+)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliDH5a，挑取經(jīng)卡那霉素篩選的陽(yáng)性菌落提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切、PCR鑒定及測(cè)序分析。
　　目的蛋白的表達(dá)、純化及抗原性分析——將提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliBL21，以異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)重組菌表達(dá)，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）及免疫印跡

3、法（WesternBlot，WB）分析表達(dá)結(jié)果。使用Ni2+-NTA親和層析柱純化目的蛋白。SDS-PAGE確定純化蛋白中無(wú)雜帶后使用BCA法測(cè)定蛋白濃度。使用純化蛋白免疫大鼠，得到抗血清，測(cè)定抗血清滴度并進(jìn)行WB分析蛋白抗原性。并使用純化的重組NAP包被ELISA板，對(duì)HP感染病人血清進(jìn)行NAP特異性IgM檢測(cè)。
　　動(dòng)物造模與rNAP干預(yù)處理——于第1、7天給6周BALB/c小鼠注射/吸入rNAP，第14天開(kāi)始按動(dòng)物造模手冊(cè)中

4、的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行小鼠哮喘造模，至第46天造模完畢，24-48小時(shí)內(nèi)完成采血、收集肺泡灌洗液及肺組織等標(biāo)本收集。隨后完成血清IgE水平、肺泡灌洗液中細(xì)胞炎癥因子水平的測(cè)定及觀察肺組織切片中的組織病變情況。
　　結(jié)果：PCR擴(kuò)增出大小約430bp左右的片段并將其成功克隆入pET-28a(+)載體。序列比對(duì)分析顯示NAP開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)435bp，預(yù)測(cè)編碼144個(gè)氨基酸，分子量為16904.92，等電點(diǎn)為5.69。經(jīng)NCBIBLAST比對(duì)與幽

5、門(mén)螺桿菌J99株和51株比對(duì)相符度均達(dá)99％。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建高效表達(dá)載體pET-28a(+)-NAP，并獲得分子量約17kDa的可溶性融合表達(dá)蛋白。用該蛋白免疫大鼠獲得多克隆抗血清效價(jià)高達(dá)1：51200，蛋白印跡陽(yáng)性證明其免疫原性及免疫反應(yīng)性均很強(qiáng)。純化的rNAP包被ELISA板，對(duì)HP感染病人血清進(jìn)行NAP特異性IgM檢測(cè)，敏感度與特異度分別為91.89％和85％。
　　將經(jīng)純化的rNAP分別通過(guò)腹腔注射/霧化吸入方式作用于小鼠

6、哮喘模型，結(jié)果表明與模型相比，兩種途徑給藥均可上調(diào)促Th1反應(yīng)的IFN-γ在肺組織細(xì)胞中的分泌，與模型組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；并減緩小鼠的哮喘相關(guān)指征，明顯降低肺組織的嗜酸性粒細(xì)胞積累、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度及粘膜增厚等典型過(guò)敏性炎癥，抑制血清中總IgE水平（P<0.01），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；過(guò)敏相關(guān)的Th2炎癥因子IL-4、IL-13水平顯著低于模型組水平（P<0.01），差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：成功克隆、表達(dá)了HP-NAP基