轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HPO497參與調(diào)控幽門螺桿菌適應(yīng)克拉霉素壓力.pdf

1、目的:
　　幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）是一種螺旋狀的微需氧革蘭氏陰性細(xì)菌，生存于人類的胃粘膜表面，是目前唯——種定殖于人胃部的病原菌。幽門螺桿菌的感染是慢性活動(dòng)性胃炎、消化性潰瘍的主要病因，并與胃癌、胃黏膜相關(guān)淋巴組織(MLAT)淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān)。世界衛(wèi)生組織已將幽門螺桿菌列為第一類致癌因子，是胃癌的危險(xiǎn)因素。目前，全球約一半的人口已感染幽門螺桿菌。所以，幽門螺桿菌的清除和感染治療是防治胃癌的有

2、效手段。
　　如今，國(guó)際上清除幽門螺桿菌的通用方法是三聯(lián)療法，即，使用膠體鉍劑或質(zhì)子泵抑制劑，并同時(shí)并用兩種抗生素。常用的抗生素有:以克拉霉素為代表的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素;以甲硝唑?yàn)榇淼南趸溥蝾惪股?以阿莫西林為代表的β-內(nèi)酰胺類抗生素等。
　　克拉霉素是新一代大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，它在胃酸中表現(xiàn)穩(wěn)定，而且易于人體吸收，進(jìn)而成為了治療幽門螺桿菌感染的最常用抗生素之一。然而，由于近年來國(guó)際上對(duì)抗生素的過量使用，使得細(xì)菌對(duì)抗生素的

3、獲得性耐藥成為了引起幽門螺桿菌清除失敗的主要原因。尤其是克拉霉素的耐藥率，在國(guó)內(nèi)外均處于上升趨勢(shì)?？死顾刈饔糜诤颂求w大亞基上的23S rRNA，從而抑制蛋白質(zhì)的合成而產(chǎn)生抑菌效果。所以目前，國(guó)際上對(duì)克拉霉素耐藥機(jī)制的研究主要集中在23S rRNA位點(diǎn)的點(diǎn)突變上。然而，也有一些研究表明，在一些克拉霉素的坳耐藥株中，該點(diǎn)突變并不是造成克拉霉素耐藥的唯一因素
　　近些年來大量研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)藥物吸收降低和藥物外排增加的機(jī)制也是細(xì)菌內(nèi)在耐藥

4、機(jī)制中的重要部分。目前已發(fā)現(xiàn)三種RND家族的外排泵系統(tǒng)存在于幽門螺桿菌中參與幽門螺桿菌的耐藥壓力，分別是hefABC, hefDEF,和hefGHI基因。除了外排泵系統(tǒng)，在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中還有大量的包括吸收系統(tǒng)在內(nèi)的各種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)，在細(xì)菌中行使著不同的轉(zhuǎn)運(yùn)功能，它們是否參與幽門螺桿菌對(duì)克拉霉素的耐藥過程仍未有研究報(bào)導(dǎo)。
　　我們通過實(shí)時(shí)定量PCR篩選出在克拉霉素壓力下的野生株和克拉霉素耐藥株中表達(dá)有變化的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因HP0497，進(jìn)而

5、采用多種研究方法探討該基因在克拉霉素耐藥過程中的作用。
　　本實(shí)驗(yàn)研究主要目的在于，證實(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HP0497參與幽門螺桿菌對(duì)克拉霉素的耐藥作用和其內(nèi)在機(jī)制，并且還可能參與幽門螺桿菌的多耐藥特性。這為解決幽門螺桿菌乃至其他致病菌的多耐藥問題提供了新的思路，幫助找到新的藥物作用靶點(diǎn)，同時(shí)，也為抗生素在臨床的合理使用提供了有效指導(dǎo)。
　　方法:
　　1、使用克拉霉素處理野生株Hp26695，提取mRNA，逆轉(zhuǎn)錄出cDNA后，

6、進(jìn)行qPCR，檢測(cè)出具有表達(dá)差異的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因。將檢測(cè)出來的基因在克拉霉素耐藥株中篩查，用qPCR法找出同時(shí)具有表達(dá)差異的基因。
　　2、以野生株Hp26695為親本構(gòu)建基因敲除株△HP0497，以克拉霉素耐藥株為親本構(gòu)建基因敲除株△HP0497-a。
　　3、測(cè)定野生株Hp26695和△HP0497的生長(zhǎng)曲線。
　　4、測(cè)定野生株Hp26695和△HP0497對(duì)克拉霉素的生長(zhǎng)抑制曲線。
　　5、測(cè)定野生株Hp2

7、6695、△HP0497和△HP0497-a對(duì)克拉霉素的最小抑菌濃度。
　　6、激光共聚焦顯微鏡比較經(jīng)熒光標(biāo)記的克拉霉素處理前后的野生株Hp26695和△HP0497存活率。
　　7、測(cè)定野生株Hp26695、△HP0497和克拉霉素耐藥株在熒光積累試驗(yàn)中熒光染料H33342的殘留量。
　　8、測(cè)定轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HP0497在克拉霉素臨床耐藥株和敏感株中的表達(dá)情況。
　　9、在野生株Hp26695和△HP0497中測(cè)定

8、外排泵系統(tǒng)基因(hefABC, hefGHI)的表達(dá)量變化。
　　結(jié)果:
　　1、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HP0497在經(jīng)克拉霉素處理的幽門螺桿菌野生株Hp26695中表達(dá)顯著升高，在克拉霉素耐藥株（實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)株）中表達(dá)也升高，預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HP0497可能參與幽門螺桿菌對(duì)克拉霉素的耐藥機(jī)制。
　　2、成功構(gòu)建出以幽門螺桿菌野生株Hp26695為親本的基因敲除株△HP0497，以幽門螺桿菌克拉霉素耐藥株為親本的基因敲除株△HP0497-

9、a。
　　3、對(duì)比△HP0497與WT Hp26695的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示敲除HP0497后不影響幽門螺桿菌的生長(zhǎng)活力。
　　4、對(duì)比△HP0497與WT Hp26695的對(duì)克拉霉素的殺菌曲線、最小抑菌濃度、激光共聚焦圖片，表明敲除了HP0497后幽門螺桿菌對(duì)克拉霉素的敏感性顯著升高。
　　5、對(duì)比△HP0497與WT Hp26695的熒光染料積累量，結(jié)果顯示敲除HP0497后幽門螺桿菌中染料H33342的積累量顯著升

10、高。
　　6、對(duì)比臨床克拉霉素耐藥株和敏感株中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HP0497的表達(dá)情況，結(jié)果顯示其在耐藥株的表達(dá)明顯高于敏感株。
　　7、對(duì)比△HP0497與WTHp26695中外排泵系統(tǒng)(hefABC, hefGHI)的表達(dá)情況，結(jié)果顯示敲除HP0497后，兩種外排系統(tǒng)表達(dá)顯著降低。
　　結(jié)論:
　　轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HP0497在幽門螺桿菌對(duì)克拉霉素適應(yīng)的過程中起著重要作用，能夠通過一定的機(jī)制影響下游外排泵(hefABC, he