橙色莫桑比克羅非魚和荷那龍羅非魚Ghrelin和GHSR基因的克隆及組織表達研究.pdf

1、生長激素促分泌素受體(growth hormone secretagogue receptor，GHSR)屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族成員，是生長激素促分泌素(Ghrelin)的一種新發(fā)現(xiàn)的受體。研究表明，Ghrelin與其受體GHSR結(jié)合后，具有促進生長激素分泌，促進攝食，調(diào)節(jié)體重，并參與能量平衡的調(diào)節(jié)等生理功能。本實驗通過對莫桑比克羅非魚和荷那龍羅非魚Ghrelin/GHSR基因結(jié)構(gòu)、功能及其組織分布和饑餓對Ghrelin和GHSR mR

2、NA表達量的影響的研究，探討羅非魚生長發(fā)育的調(diào)控機制，為培育快速生長的羅非魚養(yǎng)殖品種提供理論依據(jù)。 本實驗采用RT-PCR技術(shù)從荷那龍羅非魚胃總RNA中擴增得到Ghrelin cDNA全序列，對其進行序列測定和分析，結(jié)果表明荷那龍羅非魚Ghrelin cDNA總長833bp，開放閱讀框(ORF)為324bp，編碼107個氨基酸的前體蛋白。其中包括22個氨基酸的成熟肽。成熟肽氨基酸序列GSSFLSPSQKPQNKVKSSRI，成熟

3、肽N-末端第3位氨基酸為絲氨酸，和其他已知脊椎動物該基因位點上的氨基酸類別相同。采用半定量RT-PCR方法檢測雌、雄荷那龍羅非魚胃、肌肉和垂體等組織中Ghrelin基因的表達，結(jié)果顯示，荷那龍羅非魚Ghrelin基因有廣泛的組織分布，Ghrelin基因在雌、雄魚胃中的表達量均最高，在其它組織的表達量存在雌雄個體差異。雌魚肌肉中Ghrelin基因的表達量明顯高于雄魚，是雄魚的132倍。為了進一步研究Ghrelin基因的表達在荷那龍羅非魚體

4、內(nèi)受能量水平的影響，實驗魚饑餓4周后，采用熒光定量RT-PCR方法檢測胃中Ghrelin基因表達量變化，結(jié)果表明：饑餓組較對照組Ghrelin mRNA表達量有增加，饑餓組個體中Ghrelin基因表達量最高的個體的表達量比對照組中表達量最低的個體增加了47.3倍。 采用RT-PCR和RACE技術(shù)從莫桑比克羅非魚和荷那龍羅非魚垂體總RNA中擴增得到GHSR cDNA全序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)羅非魚GHSR基因存在兩條cDNA鏈，命名為GHS

5、R-1a和GHSR-1b，這一結(jié)果與其他動物研究結(jié)論一致。莫桑比克羅非魚mGHSR-1a序列全長1627bp，編碼385個氨基酸；mGHSR-1b序列全長1858bp，編碼299個氨基酸。荷那龍羅非魚hGHSR-1a序列全長1630bp，編碼385個氨基酸；hGttSR-1b序列全長1861bp，編碼299個氨基酸。 為進一步了解羅非魚GHSR基因表達的調(diào)控方式，采用RT-PCR和基因組步移技術(shù)獲得了羅非魚GHSR基因的5’側(cè)翼

6、序列。其中莫桑比克羅非魚的長為1627bp，荷那龍羅非魚的長為1616bp。序列分析表明：羅非魚GHSR基因5’轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)不含TATA盒，與黑鯛、人的GHSR基因5’側(cè)翼區(qū)域有很多相同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，同時具有自身特有的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。 利用熒光定量PCR方法檢測了莫桑比克羅非魚Ghrelin基因及其受體GHSR-1amRNA水平的組織表達以及饑餓對其表達的影響。結(jié)果表明：正常生理條件下，兩基因在所檢測組織中均有表達，但存在明顯的組

7、織差異。Ghrelin主要由胃中分泌，除了性腺外，所有被檢測的組織雌魚體內(nèi)表達量高于雄魚體內(nèi)表達量，以肌肉中Ghrelin基因的表達差異最大，雌魚是雄魚的30.4倍。GHSR-1a在莫桑比克羅非魚垂體、肝臟、心臟中表達量較高，且被檢測的組織中雄魚的表達量均高于雌魚體內(nèi)的表達量，其中鰓組織的表達差異最大，雄魚是雌魚的36.3倍。饑餓4周后羅非魚胃中Ghrelin基因表達增加，雄魚Ghrelin基因分泌量增加較雌魚略高，雄魚增加了3.65倍