羅非魚和南方鲇生殖細(xì)胞幾種分子標(biāo)記的克隆和表達研究.pdf

1、性別決定和分化一直是生物學(xué)、生理學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)研究的熱點問題之一。魚類的性別在很大程度上受到環(huán)境因素如：溫度、光照、外源性激素水平的影響，甚至還能導(dǎo)致性逆轉(zhuǎn)。過去，對于性別分化的研究主要集中在對性腺體細(xì)胞的分化方面，相繼克隆了許多在魚類性別決定和分化中起重要作用的基因，并對其功能進行了深入研究。近年來，由于對性別分化的認(rèn)識不斷加深，加上魚類養(yǎng)殖的要求，對生殖細(xì)胞的分化和發(fā)育逐漸成為一個研究的熱點。對魚類生殖細(xì)胞標(biāo)記（germ cell m

2、arker）基因進行研究將為深入開展對魚類生殖細(xì)胞分化和發(fā)育分子機制研究，拓展對這一領(lǐng)域的認(rèn)識奠定堅實基礎(chǔ)，也對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)具有指導(dǎo)意義。本研究所用模式動物尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）具有生長速度快、性成熟時間快、繁殖周期短等特點，是世界最重要的養(yǎng)殖魚類之一。利用現(xiàn)代生物學(xué)手段對其進行單性化的養(yǎng)殖提出了新的要求。因此對羅非魚性別分化，特別是生殖細(xì)胞的分化和發(fā)育進行研究具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。 本實

3、驗從尼羅羅非魚克隆了幾種生殖細(xì)胞標(biāo)記，研究了它們的組織表達模式和在個體發(fā)生中的表達。同時我們還利用fadrozole（芳香化酶抑制劑）、雌二醇處理，人工誘導(dǎo)雌雄性逆轉(zhuǎn)羅非魚，研究了生殖細(xì)胞標(biāo)記在這些性逆轉(zhuǎn)魚性腺中的表達變化情況。 采用RT-PCR和RACE相結(jié)合的方法，克隆了兩個尼羅羅非魚早期發(fā)育階段的生殖細(xì)胞標(biāo)記：Figlα和Oct4?？寺〉玫降腇iglα序列長度為1254 bp，開放閱讀框（open reading fram

4、e，ORF）長度為594堿基（base pair，bp），編碼197個氨基酸（amino acid，aa）。Oct4列長度為1787 bp，ORF長度為1380 bp，編碼459個aa。它們在卵巢中的表達均高于精巢。羅非魚Figla（ntFigla）m RNA從孵化后第5天（days after hatching，dah）開始表達于雌性和雄性性腺中，并從10 dah開始呈現(xiàn)性別二態(tài)性表達，RT-PCR和定量RT-PCR（quantita

5、tive RT-PCR，qRT-PCR）都顯示，直到70 dah ntFigla在精巢的mRNA水平都維持較低水平。而性成熟后，它在精巢的表達明顯增加。ntOct4 mRNA在性腺發(fā)育的早期高表達，這暗示它在這個階段可能具有重要功能。但在孵化后1個月通過原位雜交可以檢測到它的性別二態(tài)性表達，之后它在卵巢中持續(xù)高水平表達，而在精巢中表達量逐漸降低，直到檢測不到。 采用RT-PCR和RACE相結(jié)合的方法，我們從尼羅羅非魚克隆了兩個與

6、生殖細(xì)胞減數(shù)分裂相關(guān)的基因：Spo11和Scp3。Spo11是最早分離得到的減數(shù)分裂重組基因之一，而Scp3是減數(shù)分裂聯(lián)會復(fù)合體（Synaptonemal complex，SC）的主要結(jié)構(gòu)蛋白，它們均為減數(shù)分裂特異的標(biāo)記。Scp3的cDNA序列為1070 bp，ORF為717 bp，編碼238個aa；尼羅羅非魚Spoll序列為1468 bp，ORF為1173 bp，編碼390個aa。組織分布結(jié)果表明，兩者都在羅非魚性腺中特異表達，ntS

7、cp3主要表達于精巢，而ntSpoll主要表達于卵巢。它們都能用作檢測處于減數(shù)分裂的生殖細(xì)胞。在個體發(fā)生研究結(jié)果表明，Scp3 mRNA的表達總是精巢高于卵巢，這種差異一直持續(xù)到性成熟。在卵巢中，ntScp3 mRNA主要在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ時相的卵母細(xì)胞中表達，在第Ⅳ時相的卵母細(xì)胞中表達量低，且主要集中在細(xì)胞邊緣。ntSpo11主要在卵巢中表達，這種性別差異均能在不同時期（10 dah、30 dah、40 dah、5個月和成體）檢測到。

8、 Vasa蛋白是DEAD-box蛋白家族成員中一種ATP依賴的RNA解旋酶，它在高等后生動物的生殖細(xì)胞形成中起著關(guān)鍵的作用。Vasa基因特異性地表達于許多后生動物的生殖細(xì)胞中，并被廣泛確定為許多脊椎動物和無脊椎動物生殖細(xì)胞的特異標(biāo)記。采用RT-PCR和RACE相結(jié)合的方法，從南方鲇中分離得到Vasa基因的兩個亞型，sc Vasa和sc Vasa-s。通過RACE方法獲得了它們的全長。核苷酸序列分析顯示，scVasa cDNA序列全長

9、2.563bp，其中開放閱讀框ORF長1.989bp，可以編碼含662個氨基酸的蛋白：scVasa-s cDNA序列全長2.475bp，其中開放閱讀框ORF長1.926bp，可以編碼含641個氨基酸的蛋白。scVasa-s缺乏scVasaN末端區(qū)域的一段序列。這兩種推導(dǎo)出的氨基酸序列均具有DEAD-box蛋白家族成員的特征，即含有4個精氨酸－甘氨酸－甘氨酸（RGG）基序和另外8個保守基序。它們和銀鯽的Vasa同源蛋白有很高的相似性（75

10、.2%和73.8%）。原位雜交結(jié)果表明：在卵巢，scVasa主要在Ⅰ、Ⅱ時相的卵母細(xì)胞表達，而在精巢，主要在精原細(xì)胞和初級精母細(xì)胞表達。半定量PCR結(jié)果顯示，在生殖周期中，兩種亞型在以Ⅱ時相卵母細(xì)胞為主體的卵巢恢復(fù)期表達均高于以Ⅲ-Ⅳ時相卵母細(xì)胞為主體的卵黃生成期。 本研究首次從硬骨魚類羅非魚和南方鲇系統(tǒng)的克隆了生殖細(xì)胞和減數(shù)分裂的幾種分子標(biāo)記。盡管目前國內(nèi)外眾多學(xué)者對生殖細(xì)胞和減數(shù)分裂的分子標(biāo)記進行了深入廣泛的研究，但是大都集