高溫誘導(dǎo)對(duì)羅非魚性別分化相關(guān)基因表達(dá)的影響研究.pdf

1、動(dòng)物性別決定模式是生物學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)研究問題，它對(duì)個(gè)體發(fā)育和自然種群性比組成等都具有深刻的影響。性別決定模式依據(jù)決定因素可分為基因型性別決定（Genotypic Sex Determination，GSD）和溫度依賴型性別決定(Temperature-dependentSex Determination, TSD)兩類。魚類的性別決定介于基因型性別決定(GSD)和溫度性別決定(TSD)之間，也稱為GSD+TE(Temperature Ef

2、fect)類型，即在性腺分化期溫度變化能部分影響魚類的性別決定。但溫度是如何影響魚類性別決定和分化的，至今仍是個(gè)謎。本研究以尼羅羅非魚幼魚為材料，利用qRT-PCR技術(shù)系統(tǒng)分析了高溫誘導(dǎo)對(duì)12個(gè)性別分化相關(guān)基因、4個(gè)熱休克蛋白及2個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)的影響。
　　 1.基因選擇和測(cè)序鑒定
　　 共挑選了18個(gè)在尼羅羅非魚性別分化過程中起作用的基因，其中性別分化相關(guān)基因12個(gè)，分別為:芳香化酶基因(Cyp19a1a和Cyp

3、19a1b)、Cyp11b2、Dmrt1、Fox12、Sox9a、ERα、ERβ、GTHα、FSHβ、LHβ和ARα;熱激蛋白基因4個(gè)，分別為:Hsp27、DNAJB1或Hsp40、Hsp70和Hsp90;甲基轉(zhuǎn)移酶基因2個(gè)，分別為Dnmt1和Dnmt3a。以EF-1α為持家基因。對(duì)其中7個(gè)基因(Hsp27、DNAJB1、Hsp70、Hsp90、Dnmt1、Dnmt3a和EF-1α)的預(yù)測(cè)序列進(jìn)行克隆、測(cè)序，結(jié)果表明，得到的Hsp27、

4、DNAJB1、Hsp70、Hsp90、Dnmt1、Dnmt3a和EF-1α序列與預(yù)測(cè)序列同源性為99％，而且它們的部分氨基酸序列與斑馬魚的同源性在50％～90％之間。
　　 2.尼羅羅非魚遺傳性別鑒定
　　 由于Cyp19a1a和ERβ具有性別二態(tài)性表達(dá)的特點(diǎn)，利用qRT-PCR技術(shù)，分別以Cyp19a1a和ERβ為引物，性腺cDNA為模板來(lái)鑒定本實(shí)驗(yàn)所用尼羅羅非魚幼魚的性別。結(jié)果顯示，Cyp19a1a擴(kuò)增曲線明顯分為兩

5、簇，分別代表遺傳性雌魚和雄魚;ERβ的擴(kuò)增曲線也得到了類似的結(jié)果。
　　 3.高溫誘導(dǎo)對(duì)尼羅羅非魚性別分化相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　 高溫誘導(dǎo)后雌魚Cyp19a1a及Cyp19a1a轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子—-Foxl2的相對(duì)表達(dá)水平均顯著下降(P＜0.05)。腦中控制卵巢發(fā)育的基因GTHα、 LHβ和ERα高溫誘導(dǎo)后表達(dá)水平也顯著下調(diào)(P＜0.05)，這顯示了高溫能抑制卵巢發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)。Spearman等級(jí)相關(guān)性分析結(jié)果顯示，

6、Cyp19a1a的表達(dá)量與GTHα和LHβ呈顯著性正相關(guān)(P＜0.05)。
　　 高溫誘導(dǎo)后，雌魚性腺中精巢發(fā)育相關(guān)基因Cyp11b2和Dmrt1的表達(dá)量都顯著上升(P＜0.05)。在腦中，ARα的表達(dá)量在高溫誘導(dǎo)后也顯著上升(P＜0.05)，這顯示了高溫誘導(dǎo)能提供強(qiáng)的雄性化信號(hào)。Spearman等級(jí)相關(guān)性分析結(jié)果顯示，Cyp11b2和ARα的表達(dá)量在雌魚性腺中與Cyp19a1a呈顯著性負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。
　　 4

7、.高溫誘導(dǎo)對(duì)熱休克蛋白基因mRNA表達(dá)的影響
　　 qRT-PCR結(jié)果顯示，雌雄魚性腺中Hsp27、Hsp70和Hsp90 mRNA的表達(dá)水平在高溫誘導(dǎo)后都顯著上升(P＜0.05)，恢復(fù)后又降低到對(duì)照水平。在雌魚腦中，Hsp27、DNAJB1(Hsp40)和Hsp70的表達(dá)水平都顯著上升(P＜0.05)，而雄魚腦中Hsp27、DNAJB1和Hsp90的表達(dá)量在高溫誘導(dǎo)后都無(wú)明顯變化，Hsp70在雄魚腦中的相對(duì)表達(dá)水平從對(duì)照組、誘

8、導(dǎo)組到恢復(fù)組持續(xù)升高，且相互之間存在顯著差異(P＜0.05)。
　　 5.高溫誘導(dǎo)對(duì)甲基轉(zhuǎn)移酶基因mRNA表達(dá)的影響
　　 雌雄魚性腺中Dnmt1和Dnmt3a的表達(dá)水平在高溫誘導(dǎo)后均上升，并且存在兩性差異表達(dá)。高溫誘導(dǎo)后Dnmt1和Dnmt3a在雌性尼羅羅非魚腦中的變化趨勢(shì)與在性腺中一致，而在雄魚腦中的變化趨勢(shì)卻與在性腺中的相反。顯示了高溫誘導(dǎo)能提高羅非魚雌雄魚的甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)水平，特別是Dnmt1的表達(dá)水平在雄魚性腺

9、中提高的幅度更大，高溫誘導(dǎo)可能通過影響羅非魚的甲基化水平，調(diào)控其他基因的表達(dá)，特別是性別分化相關(guān)基因的表達(dá)。
　　 總之，本文結(jié)果顯示高溫誘導(dǎo)能下調(diào)卵巢發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，上調(diào)精巢發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，初步證明了高溫誘導(dǎo)可能通過調(diào)控性腺分化相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)影響性激素合成和誘導(dǎo)羅非魚性逆轉(zhuǎn)。羅非魚熱休克蛋白和甲基轉(zhuǎn)移酶基因高溫誘導(dǎo)后的表達(dá)變化顯示了它們?cè)诟邷卣T導(dǎo)羅非魚性逆轉(zhuǎn)的過程中可能起著重要的作用。本文的結(jié)果為進(jìn)一步研究溫度影響羅