金魚雌核發(fā)育及其性別分化相關(guān)基因的表達(dá).pdf

1、人工雌核發(fā)育是一種高效的性別控制育種方式,結(jié)合性反轉(zhuǎn)技術(shù)可以使獲得的后代為全雌魚苗。本研究利用金魚(Carassius auratus)進(jìn)行了人工雌核發(fā)育的初探,旨在掌握金魚雌核發(fā)育過程中的關(guān)鍵技術(shù),之后用甲基睪酮浸浴使其性逆轉(zhuǎn)。同時(shí)分析Cyp19a、Dmrt2a、Dmrt2b基因在金魚中的表達(dá)情況,并克隆獲得Cyp19a基因全長和Dmrt2a的cDNA全長,為從分子水平上調(diào)控金魚性別分化提供理論基礎(chǔ)。
　　論文包括以下三部分內(nèi)容

2、:
　　1.本文以 Hank's液稀釋健康五花金魚精液,紫外線照射方式進(jìn)行精子滅活處理,紫外線強(qiáng)度為30mJ/cm2,照射時(shí)間為3 min。取健康紅珍珠金魚300余粒卵子人工受精。之后采用冷應(yīng)激的方法對(duì)染色體加倍處理,處理?xiàng)l件為0℃冷應(yīng)激45 min。試驗(yàn)過程中設(shè)置了一個(gè)單倍體對(duì)照組,即精子經(jīng)過相同強(qiáng)度和時(shí)間的紫外處理,但之后不經(jīng)過冷應(yīng)激。
　　孵化過程中觀察雌核發(fā)育二倍體金魚胚胎和仔魚的發(fā)育,與正常金魚無異,而單倍體對(duì)照組

3、個(gè)體出現(xiàn)了單倍體綜合癥。將雌核發(fā)育二倍體胚胎進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),然后分析核型,確定其染色體數(shù)目為2n=100。最后孵出仔魚49條,根據(jù)驗(yàn)證結(jié)果,初步確定試驗(yàn)中所使用的紫外照射和冷應(yīng)激條件是合適的。
　　2.通過3' RACE PCR方法擴(kuò)增獲得 Cyp19a基因的3’非編碼區(qū)序列,獲得 cDNA全長1,557 bp。之后通過梯度 PCR得到 Cyp19a基因內(nèi)含子序列;采用基因組步移法的獲得5'端調(diào)控區(qū)序列,拼接得到 Cyp19a基因

4、DNA全長共6,905 bp,包括9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子(GenBank登錄號(hào) No. FJ601913.1)。
　　在金魚 Cyp19a基因2000bp的5'端序列內(nèi),位于該序列-48bp處存在一個(gè)TATA框,位于-76bp處存在一個(gè) CAAT框,在線軟件預(yù)測金魚 Cyp19a基因5'端區(qū)域存在一些保守的調(diào)控因子,如甾類生成因子1基因(SF1)識(shí)別位點(diǎn),雌激素受體(ER),SOX-5,SOX-17,叉頭框(FORKHEAD)等轉(zhuǎn)

5、錄因子結(jié)合位點(diǎn)。
　　為了驗(yàn)證金魚 Cyp19a基因5'端調(diào)控區(qū)啟動(dòng)子活性,將Cyp19a基因5'端調(diào)控區(qū)插入到啟動(dòng)子缺失的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白表達(dá)載體 pEGFP-1中,之后將重組的載體轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá),在熒光倒置顯微鏡下可以檢測到綠色熒光信號(hào),表明克隆得到的金魚 Cyp19a基因5'端調(diào)控區(qū)具有啟動(dòng)子活性。
　　熒光定量分析顯示,Cyp19a主要在卵巢中表達(dá),在腦中的表達(dá)量較低,卵巢中的表達(dá)量是腦中的5倍,

6、而在其他的組織中表達(dá)量更低。比較不同發(fā)育時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量,Cyp19a在仔魚孵化后的表達(dá)量一直很低,在孵化后26天得時(shí)候表達(dá)量顯著升高,而在經(jīng)過甲基睪酮浸浴處理的26天齡的仔魚體內(nèi) Cyp19a沒有顯著升高。
　　免疫組化結(jié)果顯示,Cyp19a存在于成魚卵巢結(jié)締組織的間質(zhì)細(xì)胞中,以及孵化后48天齡的仔魚卵巢中。成魚的精巢和低于48天齡的仔魚中沒有免疫陽性反應(yīng)。
　　3.采用熒光定量 PCR技術(shù)檢測了 Dmrt2基因的兩個(gè)亞型

7、 Dmrt2a和Dmrt2b在金魚不同發(fā)育時(shí)期以及不同組織中的表達(dá)情況,用RACE技術(shù)克隆得到金魚 Dmrt2a cDNA序列的全長為1755 bp,5'和3'非編碼區(qū)長分別為188 bp和67 bp,推測的開放閱讀框可編碼499個(gè)氨基酸的多肽。分子系統(tǒng)進(jìn)化分析表明金魚 Dmrt2a與其它魚類 Dmrt2a基因聚成一支,與斑馬魚(Danio rerio)、紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes)、青鳉(Oryzias latip

8、es)、羅非魚(Oreochromis Niloticus)Dmrt2a的同源性分別為85％、61%、58%、58%。熒光定量 PCR結(jié)果揭示,Dmrt2a在精巢中表達(dá)量最高,在卵巢中次之,而 Dmrt2b在卵巢中表達(dá)量最高,在精巢中次之,二者在腎臟、消化道、肝臟、心臟和腦中都有表達(dá),但表達(dá)量低;不同發(fā)育時(shí)期胚胎和仔魚的Dmrt2a和Dmrt2b表達(dá)量差異很大,Dmrt2a在受精后24 h達(dá)到最高值,之后表達(dá)量降低,而 Dmrt2b在孵