四種鲆鰈魚(yú)類雌核發(fā)育及性別控制技術(shù)研究.pdf

1、大多數(shù)魚(yú)類雌雄個(gè)體在生長(zhǎng)速度都存在差異，根據(jù)魚(yú)類生長(zhǎng)速度的雌雄個(gè)體差異進(jìn)行性別控制和單性養(yǎng)殖可以大幅度提高產(chǎn)量和增加養(yǎng)殖效率。以大菱鲆和半滑舌鰨為代表的海水鲆鰈魚(yú)類工廠化養(yǎng)殖業(yè)的興起，掀起了海水養(yǎng)殖的第四次高潮。大多數(shù)鲆鰈魚(yú)類雌性生長(zhǎng)速度較快，因而進(jìn)行全雌的鲆鰈類苗種培育對(duì)高效的工廠化養(yǎng)殖意義更加巨大。雌核發(fā)育技術(shù)是一種非常理想的遺傳性別控制技術(shù)，結(jié)合性反轉(zhuǎn)技術(shù)可以使鲆鰈魚(yú)類全雌苗種生產(chǎn)成為可能。在本研究中，我們報(bào)道了這幾種重要海水魚(yú)類

2、的雌核發(fā)育誘導(dǎo)方法，并且通過(guò)流式細(xì)胞儀和微衛(wèi)星技術(shù)對(duì)雌核發(fā)育群體進(jìn)行了鑒定，并結(jié)合性反轉(zhuǎn)技術(shù)進(jìn)了全雌苗種的生產(chǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1．大西洋牙鲆是一種重要的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類。在本研究中，采用紫外線(UV)照射冷凍保存的花鱸精子和大西洋牙鲆精子誘導(dǎo)犬齒牙鲆雌核發(fā)育。實(shí)驗(yàn)表明：犬齒牙鲆同源精子經(jīng)80mJ/cm2的紫外線照射可以完全失活，凍存花鱸精子經(jīng)紫外線照射后也同樣具有誘導(dǎo)犬齒牙鲆雌核發(fā)育能力。無(wú)論同源精子還是異源精子，最佳誘導(dǎo)條件為，在1

3、8℃條件下，精子經(jīng)80mJ/cm2的紫外線照射，在受精后4～5min，將受精卵放在3℃海水中進(jìn)行冷休克處理，持續(xù)時(shí)間為45min，同源精子和異源精子二倍體誘導(dǎo)分別為32.66±7.03％和28.00±6.48％。采用形態(tài)學(xué)、流式細(xì)胞儀DNA含量分析和微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)對(duì)雌核發(fā)育魚(yú)苗進(jìn)行了分析，證明了雌核發(fā)育魚(yú)苗為雌核發(fā)育二倍體。100尾雌核發(fā)育群體中雌性共38尾，占38％，雄性62尾，占62％。按不同方法進(jìn)行雄性激素處理2700余尾，培育1

4、年后，雄性比例為100％。 2．漠斑牙鲆是一種具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的深海比目魚(yú)類。由于漠斑牙鲆雌性生長(zhǎng)快，因此通過(guò)雌核發(fā)育獲得漠斑牙鲆雌性群體是一種有效方法。雌核發(fā)育實(shí)驗(yàn)表明：同源精子只有經(jīng)紫外線照射遺傳失活后才能誘導(dǎo)雌核發(fā)育，否則形成三倍體，而花鱸精子也只有經(jīng)過(guò)紫外線照射遺傳失活后，才能誘導(dǎo)產(chǎn)生漠斑牙鲆雌核發(fā)育二倍體魚(yú)苗，雜交胚可發(fā)育，但不能存活至孵化。經(jīng)實(shí)驗(yàn)篩選出誘導(dǎo)漠斑牙鲆雌核發(fā)育的最佳條件為：花鱸冷凍精子采用80mJ/cm2

5、的紫外線照射，然后與卵子進(jìn)行授精，在受精后4～5min，施以65MPa的靜水壓休克處理6min。采用形態(tài)學(xué)、流式細(xì)胞儀DNA含量分析和微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)對(duì)雌核發(fā)育魚(yú)苗進(jìn)行了分析，證明了雌核發(fā)育魚(yú)苗為雌核發(fā)育二倍體。培育1年后的雌核發(fā)育群體經(jīng)鑒定，雌性占42.8％；雄性激素浸泡處和投喂處理后的雄性比例分別達(dá)了95.3％和97.5％。 3．條斑星鰈是一種大型冷水性經(jīng)濟(jì)魚(yú)類。由于條斑星鰈雌性生長(zhǎng)快于雄性，在生產(chǎn)上獲得全雌群體對(duì)條斑星鰈具有

6、重要意義。使用花鱸精子和同源精子誘導(dǎo)條斑星鰈雌核發(fā)育，結(jié)果顯示花鱸精子只有經(jīng)過(guò)紫外線照射遺傳失活后，才能誘導(dǎo)產(chǎn)生條斑星鰈雌核發(fā)育二倍體魚(yú)苗。經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)篩選出誘導(dǎo)條斑星鰈雌核發(fā)育的最佳條件為：花鱸冷凍精子采用80mJ/cm2的紫外線照射，然后與條斑星鰈卵子進(jìn)行授精，在受精后7～9min，將受精卵放在-1.0～1.5℃海水中進(jìn)行冷休克處理，持續(xù)時(shí)間為60～90min，在此條件下，獲得的雌核發(fā)育二倍體的最高誘導(dǎo)率達(dá)40.68％±7.24％。

7、由于不失活精子與條斑星鰈卵形成的雜交胚只能存活到原腸期，而染色體未被成功加倍的胚胎會(huì)由于單倍體的致死效應(yīng)在孵化前后死亡，所以存活的仔魚(yú)全部為條斑星鰈雌核發(fā)育二倍體。采用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)對(duì)雌核發(fā)育魚(yú)苗進(jìn)行了分析，證明了雌核發(fā)育魚(yú)苗為雌核發(fā)育二倍體。培育一年后經(jīng)鑒定，雌核發(fā)育群體生別比例為42.7％；高溫、激素和投喂激素處理雌核發(fā)育群體和正常苗種，只出現(xiàn)了個(gè)別雌性個(gè)體，雄性比例達(dá)95.1％～100％ 4．半滑舌鰨是新近開(kāi)發(fā)的一種重要的

8、經(jīng)濟(jì)海洋魚(yú)類。為了獲得半滑舌鰨全雌苗種并闡明其性別機(jī)制，本文首先采用冷凍保存的鱸魚(yú)精子作為刺激半滑舌鰨卵子進(jìn)行雌核發(fā)育的有效精子源，建立了精子遺傳失活的條件；其次，篩選出有效的冷休克起始時(shí)間、適合的冷休克溫度和冷休克處理時(shí)間。獲得了異源冷凍精子-鱸魚(yú)精子誘導(dǎo)產(chǎn)生的半滑舌鰨雌核發(fā)育魚(yú)苗。采用常規(guī)方法對(duì)雌核發(fā)育胚胎進(jìn)行了染色體分析，觀察到單倍體染色體數(shù)目為21條，雌核發(fā)育二倍體染色體數(shù)目為42條，觀察到含有2條W染色體的個(gè)體，表明雌核發(fā)育二

9、倍體包含有ZZ和WW兩種類型；采用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)雌核發(fā)育魚(yú)苗進(jìn)行了分析，證明了雌核發(fā)育魚(yú)苗的可靠性；采用半滑舌鰨雌性特異AFLP標(biāo)記對(duì)雌核發(fā)育魚(yú)苗進(jìn)行了遺傳性別鑒定，獲得了具有雌性特異DNA標(biāo)記的雌核發(fā)育二倍體魚(yú)苗。在10多次雌核發(fā)育實(shí)驗(yàn)中獲得雌核發(fā)育二倍體魚(yú)苗6600多尾。在魚(yú)苗長(zhǎng)大后鑒定生理性別，其中同源精子誘導(dǎo)組雌性比例為11.5％，異源精子誘導(dǎo)組雌性比例為17.7％，而同批次正常對(duì)照組雌性比例45.8±8.2％。雌核發(fā)育群體雌性比