外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)對(duì)宿主菌的影響.pdf

1、大腸桿菌(Escherichia coli)具有遺傳背景清楚、生長(zhǎng)速度快、生長(zhǎng)周期短、安全性好、可以進(jìn)行高密度培養(yǎng)和適合表達(dá)不同基因產(chǎn)物等特點(diǎn)，是科研和工業(yè)生產(chǎn)上表達(dá)外源基因的常用宿主。然而，外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)常會(huì)給宿主造成強(qiáng)烈的代謝負(fù)擔(dān)，導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)下降及自身蛋白合成產(chǎn)物減少，這方面國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有很多的研究報(bào)道。綜合分析國(guó)內(nèi)外的研究成果，我們發(fā)現(xiàn)，迄今對(duì)帶有T7強(qiáng)啟動(dòng)子的pET表達(dá)載體的研究報(bào)道甚少，而且采用非變性SDS-PAGE技術(shù)來(lái)

2、研究外源基因表達(dá)對(duì)宿主菌的影響也罕有報(bào)道。 本研究以Escherichia coli BL21(DE3)和帶T7啟動(dòng)子的pET。載體的誘導(dǎo)表達(dá)為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)宿主菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定，全菌蛋白非還原性SDS.PAGE分析和差異蛋白的串聯(lián)質(zhì)譜鑒定等研究方法，考察了IPTG誘導(dǎo)pET質(zhì)粒外源基因表達(dá)對(duì)宿主菌生理和蛋白表達(dá)的影響，主要研究結(jié)果如下： 1)大腸桿菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果：帶外源基因的pET質(zhì)粒和空載的pET質(zhì)粒經(jīng)IPTG誘

3、導(dǎo)表達(dá)對(duì)宿主菌的生長(zhǎng)造成嚴(yán)重的抑制作用，實(shí)驗(yàn)組的OD600nm值比對(duì)照組平均減少53.56％，而且宿主菌對(duì)外界環(huán)境變化的應(yīng)激力下降。 2)大腸桿菌總蛋白含量測(cè)定結(jié)果：表達(dá)外源基因的宿主菌的總蛋白含量比不經(jīng)誘導(dǎo)的宿主菌減少40.86％，說(shuō)明pET質(zhì)粒的強(qiáng)烈表達(dá)使得宿主菌蛋白的表達(dá)明顯減少。 3)全菌蛋白電泳圖譜結(jié)果：帶有質(zhì)粒并經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的宿主菌的蛋白PAGE膠上有兩條蛋白條帶明顯消失，消失時(shí)間是在加入誘導(dǎo)劑0.5h-1h之

4、間，而且蛋白消失后菌體表現(xiàn)為生長(zhǎng)受阻，生長(zhǎng)曲線OD600nm值不增長(zhǎng)。 4)MALDI-TOF MS/MS鑒定結(jié)果：消失的蛋白分別為Outer membrane protein F(OmpF)和Bacterioferritin(Bfr),OmpF是細(xì)胞外膜的重要的結(jié)構(gòu)蛋白，可形成對(duì)小分子親水物質(zhì)進(jìn)行被動(dòng)運(yùn)輸?shù)哪た椎溃珺fr主要起菌體內(nèi)鐵離子的解毒和儲(chǔ)存鐵離子的作用。 全文研究結(jié)果表明帶有T7強(qiáng)啟動(dòng)子的pET質(zhì)粒表達(dá)對(duì)宿主