外源基因整合及其對(duì)棉花受體親本的影響.pdf

1、棉花是重要的經(jīng)濟(jì)作物，轉(zhuǎn)基因棉花在棉花生產(chǎn)中發(fā)揮著越來(lái)越大的作用?；ǚ酃芡ǖ婪ㄊ敲藁ㄟz傳轉(zhuǎn)化的主要方法之一。到目前為止，我國(guó)的轉(zhuǎn)基因棉花品種中有40％以上是直接或間接通過花粉管通道法獲得的?；ǚ酃芡ǖ婪ㄟz傳轉(zhuǎn)化機(jī)理，轉(zhuǎn)化的外源基因在受體親本中的分布以及外源基因?qū)κ荏w的影響等方面的系統(tǒng)研究較少。本研究以源于同一受體親本的30個(gè)的棉花轉(zhuǎn)基因系為材料，分析轉(zhuǎn)基因系表型變異的特點(diǎn)及規(guī)律，采用PCR Walking技術(shù)對(duì)外源基因整合的側(cè)翼序列進(jìn)行

2、克隆，初步研究其整合特點(diǎn)；應(yīng)用DDRT-PCR方法分析了轉(zhuǎn)基因系與受體親本之間的基因表達(dá)差異，探討表型變異的分子機(jī)理；同時(shí)應(yīng)用mAD模型對(duì)轉(zhuǎn)基因系中外源基因整合的遺傳效應(yīng)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，從遺傳效應(yīng)上對(duì)外源基因?qū)κ荏w親本的影響進(jìn)行了評(píng)估。本研究的主要結(jié)論如下： 1.建立了以PCR walking技術(shù)為基礎(chǔ)的，在花粉管通道法轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因系中克隆FST序列的技術(shù)體系。對(duì)12個(gè)轉(zhuǎn)基因系的FST序列進(jìn)行了克隆，共獲得9個(gè)序列片段，其中5個(gè)全為

3、載體序列，四個(gè)序列中包含未知序列，側(cè)翼序列的有效獲得率為33.3％。 2.對(duì)獲得序列通過DNAman軟件進(jìn)行比對(duì)分析，外源基因整合時(shí)可以攜帶更多載體序列一起整合到棉花基因組中，而不局限于邊界序列，邊界序列并不是整合所必需的。外源基因表達(dá)盒中的部分序列(35S啟動(dòng)子序列，GUS序列)以及質(zhì)粒載體部分序列(如OriV)出現(xiàn)在側(cè)翼序列中。應(yīng)用Blast在internet上對(duì)未知序列進(jìn)行查詢分析，認(rèn)為4個(gè)有效序列中，三個(gè)位于棉花基因區(qū)，

4、一個(gè)位于棉花的重復(fù)序列或冗余序列等基因間區(qū)。 3.通過花粉管通道法轉(zhuǎn)入外源基因會(huì)引起受體親本的較大的表型變異。轉(zhuǎn)基因系的表型變化和外源基因的類型沒有相關(guān)性。各轉(zhuǎn)基因系整體上對(duì)纖維品質(zhì)性狀影響小，對(duì)產(chǎn)量及產(chǎn)量構(gòu)成因素的影響較大。大部分轉(zhuǎn)基因系(90％)在對(duì)鈴重的影響上具有相似的變化規(guī)律，會(huì)顯著或極顯著地降低鈴重。46.7％的轉(zhuǎn)化系衣分沒有顯著變異，20％會(huì)顯著或極顯著地增加，33.3％會(huì)顯著或極顯著的降低。 4.兩個(gè)轉(zhuǎn)基因

5、系在純合狀態(tài)下總的基因表達(dá)差異率高于其受體親本，說明外源基因的整合效應(yīng)可促使受體親本更多基因表達(dá)差異表達(dá)。但并不是在不同發(fā)育時(shí)期內(nèi)都高于其受體親本，在初花期(7月1日)和盛花期(7月15日)，兩轉(zhuǎn)基因系的基因表達(dá)差異率明顯高于受體親本，而蕾期(6月15日)和花鈴期(8月1日)，卻低于受體親本。在雜合狀態(tài)下，獲得的平均重復(fù)序列條帶數(shù)高于純合狀態(tài)下條帶數(shù)，同時(shí)基因表達(dá)差異條帶數(shù)也較大，但是其基因表達(dá)差異率卻小于純合狀態(tài)。不同的轉(zhuǎn)基因系在雜合

6、狀態(tài)下的基因表達(dá)差異率變化規(guī)律相似，均小于純合狀態(tài)下的差異率。 5.應(yīng)用 mAD 模型對(duì)轉(zhuǎn)基因系 439030的 dQTL 效應(yīng)進(jìn)行分解研究。結(jié)果表明439030的 dQTL 可顯著地增加衣分和鈴數(shù)，降低鈴重，具有顯著的加性效應(yīng)，說明在轉(zhuǎn)基因系 439030 中，外源基因整合效應(yīng)所影響的 QTL 位點(diǎn)具有增加衣分(1.00±0.36<'*>)和鈴數(shù)(9.71±1.60<'*>)，降低鈴重(-0.57±0.06<'**>)的遺傳效