外源刺激對(duì)擬南芥基因組修飾和基因表達(dá)的影響.pdf

1、病蟲(chóng)害是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中重要的危害之一，現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中主要通過(guò)施用農(nóng)藥來(lái)控制病蟲(chóng)害。而農(nóng)藥長(zhǎng)期大量的施用，不僅會(huì)污染生態(tài)環(huán)境，帶來(lái)一系列生態(tài)問(wèn)題，同時(shí),農(nóng)藥殘留也給人們的健康帶來(lái)巨大危害。在此之前,大量的研究集中于農(nóng)藥施用過(guò)程中對(duì)空氣造成的污染和對(duì)操作者身體健康的影響，而關(guān)于農(nóng)藥施用到農(nóng)作物上之后,對(duì)農(nóng)作物本身所帶來(lái)的影響，卻較為缺乏。關(guān)于施用農(nóng)藥對(duì)作物DNA甲基化及基因表達(dá)的影響方面的研究更為缺乏。多菌靈是一種重要的殺菌劑，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中

2、得到了廣泛的應(yīng)用。本研究以擬南芥為材料，研究多菌靈對(duì)擬南芥親代（T0代）及子代（T1代）基因組DNA甲基化變化和基因表達(dá)的影響。以多菌靈處理擬南芥培養(yǎng)基,設(shè)置了4個(gè)濃度梯度0m mol/l(CK),0.05m mol/l（D1），0.1m mol/l(D2),0.2m mol/l(D3)。對(duì)處理材料進(jìn)行了生長(zhǎng)和生理生態(tài)檢測(cè)以及AFLP，MSAP分子標(biāo)記檢測(cè)。并對(duì)CK，D2，D3三個(gè)處理進(jìn)行了基因甲基化芯片和基因組表達(dá)譜芯片分析。結(jié)果如下

3、：
　　1.多菌靈對(duì)T0代的影響
　　與對(duì)照相比,多菌靈處理20d的擬南芥植株葉片有略微增厚，卷曲的現(xiàn)象；主根顯著變短，側(cè)根明顯增多；葉片葉綠素含量有顯著增加。
　　生長(zhǎng)20d的幼苗(不含根)DNA用AFLP法（共使用8對(duì)引物）,共擴(kuò)增出776條可統(tǒng)計(jì)條帶，這些條帶中未出現(xiàn)多態(tài)性位點(diǎn)，說(shuō)明處理組與對(duì)照組之間的基因組序列保持一致，多菌靈處理擬南芥沒(méi)有誘導(dǎo)出本方法可以檢測(cè)到的遺傳變異。
　　經(jīng)過(guò)MSAP分析，與對(duì)照相

4、比，0.05m mol/l多菌靈處理（D1）基因組DNA的甲基化率為0.862％，去甲基化率為0.69%。與對(duì)照（CK）相比，0.1m mol/l多菌靈處理（D2）基因組DNA甲基化率為0.871%，去甲基化率為0.871%。與對(duì)照相比,0.2m mol/l多菌靈處理（D3）基因組DNA甲基化率為1.193%,去甲基化率為1.363%。
　　使用擬南芥全基因組甲基化芯片分析全基因組范圍內(nèi)基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化情況發(fā)現(xiàn)，對(duì)照CK有甲基

5、化區(qū)域6671個(gè)，D2有甲基化區(qū)域6690個(gè)，D3有7193個(gè)。其中D2相對(duì)于對(duì)照發(fā)生甲基化增加的區(qū)域有1541個(gè),去甲基化的區(qū)域有1522個(gè)，甲基化率為0.4%，去甲基化率為0.395%。D3相對(duì)于對(duì)照發(fā)生甲基化增加的區(qū)域有2790個(gè)，去甲基化的區(qū)域有2278個(gè)，發(fā)生甲基化率為0.725%，去甲基化率為0.592%。兩處理均發(fā)生甲基化增加的區(qū)域有472個(gè)，占總數(shù)的0.123%，兩處理均發(fā)生去甲基化的區(qū)域有872個(gè)，占總數(shù)的0.226%

6、。其中還發(fā)現(xiàn)有轉(zhuǎn)錄因子基因啟動(dòng)子發(fā)生了甲基化變化。其中16個(gè)甲基化程度增加的，11個(gè)甲基化程度減少。
　　擬南芥基因組DNA表達(dá)譜芯片分析發(fā)現(xiàn)，多菌靈處理引起基因表達(dá)的改變，D2相對(duì)于對(duì)照表達(dá)上調(diào)2倍的基因有1618個(gè),下調(diào)2倍的有1194個(gè)。D3相對(duì)于對(duì)照,表達(dá)上調(diào)2倍的基因有2665個(gè)，下調(diào)2倍的有3081個(gè)。一些基因的表達(dá)變化也引起相關(guān)代謝通路的變化。生物信息學(xué)功能數(shù)據(jù)庫(kù)KEGG做pathway分析，這些基因表達(dá)變化共涉及到

7、32個(gè)信號(hào)通路的變化。其中D2涉及到21個(gè)，D3涉及到25個(gè)信號(hào)通路。D2、D3均受到影響的通路有14個(gè)。
　　DNA甲基化芯片和表達(dá)譜芯片聯(lián)合分析表明,D2發(fā)生去甲基化且表達(dá)上調(diào)的基因有46個(gè)，D3發(fā)生去甲基化且表達(dá)上調(diào)的基因有80個(gè)，兩個(gè)多菌靈添加處理均發(fā)生去甲基化且表達(dá)上調(diào)的基因有21個(gè)。D2發(fā)生重新甲基化且表達(dá)下調(diào)的基因有45個(gè)，D3發(fā)生重新甲基化且表達(dá)下調(diào)的基因有71個(gè)，兩個(gè)多菌靈處理材料均發(fā)生重新甲基化且表達(dá)下調(diào)的基因

8、有3個(gè)。
　　從甲基化芯片和表達(dá)譜芯片聯(lián)合分析結(jié)果里，挑取與生長(zhǎng)發(fā)育和逆境刺激相關(guān)的幾個(gè)基因，其發(fā)生去甲基化引起了表達(dá)上調(diào)。AN3、ATFER4、BT4、MEK1、SPL8這5個(gè)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR驗(yàn)證分析。結(jié)果顯示,多菌靈處理的樣本中這5個(gè)基因的表達(dá)與對(duì)照相比均有不同程度的上調(diào)，這與芯片檢測(cè)結(jié)果是基本相符的。
　　經(jīng)過(guò)甲基化與表達(dá)譜數(shù)據(jù)比對(duì)分析,我們發(fā)現(xiàn)多菌靈或參與啟動(dòng)擬南芥防御基因表達(dá)的路徑,多菌靈使得該途徑中初始幾個(gè)

9、關(guān)鍵基因（AT1G35710，EFR，VSR6，MEKK1，MEK1）發(fā)生去甲基化,引起其表達(dá)極顯著上調(diào),最終引起防御基因（PAD3，NUDT6，F(xiàn)RK1，NHO1）的表達(dá)大幅上調(diào),這是世界上農(nóng)藥啟動(dòng)植物防御系統(tǒng)的首例報(bào)道。也是第一次比較完整的推理出多菌靈啟動(dòng)植物防御系統(tǒng)的作用通路。
　　2.多菌靈處理對(duì)擬南芥子代(T1)的影響
　　多菌靈處理過(guò)的親本的子代發(fā)育正常，側(cè)根較多。而對(duì)照則發(fā)現(xiàn)污染率高，苗相對(duì)較弱。AFLP分子標(biāo)

10、記檢測(cè)，共用了8對(duì)引物，擴(kuò)增出528條帶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩處理與對(duì)照相比，均未發(fā)現(xiàn)有多態(tài)性的條帶，表明親代苗經(jīng)多菌靈處理后，子代苗的基因組沒(méi)有發(fā)生本方法可檢測(cè)的DNA序列變異。
　　經(jīng)過(guò)MSAP分析，0.1m mol/l多菌靈處理（D2）的子代(D2T1)與對(duì)照（CKT1）相比，全基因組的甲基化率為0.475%，去甲基化率為0.634%。0.2m mol/l多菌靈處理（D3T1）與對(duì)照相比,甲基化率為1.08%,去甲基化率為1.235

11、%。
　　芯片分析全基因組范圍內(nèi)基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化情況發(fā)現(xiàn)，D2T1相對(duì)于對(duì)照發(fā)生甲基化增加的區(qū)域有2218個(gè),去甲基化的區(qū)域有3075個(gè)，D3T1相對(duì)于對(duì)照發(fā)生甲基化增加的區(qū)域有3500個(gè)，去甲基化的區(qū)域有4269個(gè)。另外，D2T1代對(duì)照相比保持與去甲基化的有591個(gè)區(qū)域,保持甲基化增加的區(qū)域有353個(gè)。D3T1代保持去甲基化的有147個(gè)區(qū)域,保持甲基化增加的有207個(gè)區(qū)域。
　　為了驗(yàn)證甲基化芯片結(jié)果,挑選了在芯片分析

12、中發(fā)生去甲基化的4個(gè)基因進(jìn)行了甲基化特異性PCR檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明多菌靈處理組的這4個(gè)基因均發(fā)生了去甲基化，這與芯片檢測(cè)結(jié)果是一致的。同時(shí)這4個(gè)基因的表達(dá)也發(fā)生了不同程度的上調(diào)。
　　子代多菌靈處理組與對(duì)照相比，基因表達(dá)差異也普遍存在。D2與對(duì)照相比，表達(dá)上調(diào)2倍的基因有3108個(gè)，下調(diào)2倍的有3429個(gè)；而D3與對(duì)照相比，表達(dá)上調(diào)2倍的基因有4381個(gè)，下調(diào)2倍的有4651個(gè)。
　　D2與對(duì)照相比，有30個(gè)基因在T1代保持

13、了甲基化增加并且表達(dá)水平下調(diào)2倍以上，21個(gè)基因保持了去甲基化并且表達(dá)水平上調(diào)2倍以上。D3處理與對(duì)照相比，有9個(gè)基因保持甲基化增加并表達(dá)下調(diào)，11個(gè)基因保持了去甲基化并表達(dá)上調(diào)。其中一些基因DNA甲基化與基因表達(dá)關(guān)聯(lián)性變化與親代相同。其中涉及的代謝通路與T0代基本相同。
　　由上述結(jié)果,我們還看到,雖然上一代基因的甲基化有大約5-10%遺傳給了下一代,但是卻只有大約0.5%的基因的甲基化繼續(xù)影響了該基因的表達(dá)狀況。
　　3

14、.結(jié)論
　　(1)施用多菌靈使擬南芥親代（T0）基因組DNA發(fā)生了廣泛的去甲基化和重新甲基化。
　　(2)多菌靈施用導(dǎo)致擬南芥全基因組范圍基因表達(dá)發(fā)生了顯著的變化，一些代謝途徑也因此受到顯著影響。
　　(3)多菌靈添加可能通過(guò)啟動(dòng)并影響病菌與植物相互作用通路中的幾個(gè)關(guān)鍵基因去甲基化而使下游的防御基因表達(dá)上調(diào),最終達(dá)到殺死致病菌的目的。
　　(4)擬南芥子代(T1)的表型和DNA甲基化狀況仍然受到親代(T0)施用多