雙Bt基因?qū)顦?shù)的遺傳轉(zhuǎn)化及外源基因表達(dá)研究.pdf

1、為鑒定并篩選出轉(zhuǎn)雙Bt基因741楊對(duì)鱗翅目和鞘翅目害蟲(chóng)同時(shí)具有較強(qiáng)抗性的株系，明確聯(lián)合使用兩種或兩種以上的抗蟲(chóng)基因的抗蟲(chóng)效果。以8個(gè)轉(zhuǎn)三基因雙Bt（Cry3Aa+Cry1Ac+API）741楊株系、1個(gè)轉(zhuǎn)雙抗蟲(chóng)基因（Cry1Ac+API）741楊株系和3個(gè)轉(zhuǎn)單抗蟲(chóng)基因（Cry3Aa）741楊株系為實(shí)驗(yàn)材料，未轉(zhuǎn)基因741楊為對(duì)照，進(jìn)行了外源基因表達(dá)測(cè)定和抗蟲(chóng)性對(duì)比試驗(yàn)。同時(shí)借助農(nóng)桿菌介導(dǎo)，采用共轉(zhuǎn)化法，用構(gòu)建在同一表達(dá)載體pCAMBIA

2、1305-Cry1Ac-Cry3Aa上的雙Bt基因?qū)薨詶钸M(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了4株潮霉素抗性植株。經(jīng)過(guò)PCR初步檢測(cè)，表明雙Bt基因已經(jīng)整合進(jìn)了巨霸楊基因組中。主要研究結(jié)果如下：
　　1.轉(zhuǎn)抗蟲(chóng)基因741楊分別為：?jiǎn)无D(zhuǎn)Bt Cry3Aa基因741楊pCC系列3個(gè)株系pCC11、pCC53、pCC84；轉(zhuǎn)雙抗蟲(chóng)基因（Cry1Ac+API）741楊1個(gè)株系pB29；在pB29基礎(chǔ)上通過(guò)二次轉(zhuǎn)化法將Cry3Aa基因轉(zhuǎn)入獲得的轉(zhuǎn)三基因雙B

3、t（Cry3Aa+Cry1Ac+API）741楊pCCA系列8個(gè)株系pCCA1、pCCA2、pCCA3、pCCA4、pCCA5、pCCA6、pCCA7和pCCA9。對(duì)各轉(zhuǎn)基因株系及對(duì)照進(jìn)行組培快繁，篩選確立了誘導(dǎo)741楊分化和生根的適宜培養(yǎng)基。分化培養(yǎng)基為：MS+6BA1.0mg·L-1+NAA0.1mg·L-1；生根培養(yǎng)基為：1/2MS+IBA0.3mg·L-1。
　　2.轉(zhuǎn)雙Bt基因741楊等13個(gè)參試材料經(jīng)特異引物PCR擴(kuò)增

4、Cry1Ac基因和Cry3Aa基因：pB29和轉(zhuǎn)雙Bt基因pCCA系列均擴(kuò)增得到了Cry1Ac基因特異條帶，對(duì)照741和pCC系列基因組未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。pCC系列和轉(zhuǎn)雙Bt基因pCCA系列均得到了Cry3Aa基因特異條帶，對(duì)照741和pB29基因組未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。說(shuō)明pB29中Cry1Ac基因和pCC系列中的Cry3Aa基因穩(wěn)定存在。在pB29基礎(chǔ)上，通過(guò)二次介導(dǎo)法外源Cry3Aa基因已整合到pCCA各無(wú)性系基因組中。
　　3.通

5、過(guò)RT-PCR和熒光定量PCR結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)外源基因的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光監(jiān)測(cè)表明：8個(gè)雙Bt株系即檢測(cè)到了Cry1Ac熒光擴(kuò)增信號(hào)又檢測(cè)到了Cry3Aa基因的熒光擴(kuò)增信號(hào)。pCC-11、53、84只有Cry3Aa基因的熒光信號(hào)表達(dá)，而pB29只有Cry1Ac基因的熒光信號(hào)表達(dá)，對(duì)照741沒(méi)有顯現(xiàn)雙Bt基因的熒光擴(kuò)增信號(hào)。根據(jù)測(cè)得的Ct值，計(jì)算出了各樣品中Cry1Ac基因和Cry3Aa基因在mRNA轉(zhuǎn)錄本中的表達(dá)量。雙Bt株系p

6、CCA系列及pB29中Cry1Ac基因的起始表達(dá)量在3.26×104~7.50×105之間；雙Bt株系pCCA系列及pCC系列Cry3Aa基因的起始表達(dá)量在1.79×108~6.05×109之間。數(shù)據(jù)顯示Cry3Aa基因的起始表達(dá)量在108~109數(shù)量級(jí)，比Cry1Ac的起始表達(dá)量（104~105數(shù)量級(jí)）高出了一萬(wàn)倍。
　　4.用Bt-Cry1Ab/1Ac和Bt-Cry3A ELISA蛋白檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)Cry1Ac蛋白：雙Bt7

7、41楊pCCA系列的8個(gè)系號(hào)和pB29呈現(xiàn)藍(lán)色陽(yáng)性反應(yīng)，蛋白含量在16.44~60.32 ng·g-1（FW）；pCC系列和對(duì)照741無(wú)顯色反應(yīng)。檢測(cè)Cry3Aa蛋白：雙Bt741楊8個(gè)系號(hào)及pCC系列呈現(xiàn)黃色陽(yáng)性反應(yīng)，蛋白含量在2.24~13.30μg·g-1（FW）；pB29和對(duì)照741無(wú)顯色反應(yīng)。檢測(cè)結(jié)果表明，雙Bt株系能同時(shí)表達(dá)兩種Bt毒蛋白，單Bt株系也表達(dá)了與各自所含基因相應(yīng)的蛋白。從毒蛋白表達(dá)量看Cry3Aa蛋白表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)

8、高于Cry1Ac蛋白表達(dá)量。Cry3Aa蛋白表達(dá)量在微克級(jí)，Cry1Ac蛋白表達(dá)量在納克級(jí)。
　　5.用轉(zhuǎn)基因株系新鮮葉片進(jìn)行柳藍(lán)葉甲（Plagiodera versicolora）1~3齡幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)及美國(guó)白蛾（Hyphantria cunea）1齡和4齡幼蟲(chóng)室內(nèi)飼蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)表明：轉(zhuǎn)入不同抗蟲(chóng)基因的楊樹(shù)對(duì)昆蟲(chóng)的抗性具有選擇性，對(duì)非靶標(biāo)昆蟲(chóng)沒(méi)有毒殺作用。轉(zhuǎn)雙Bt基因741楊對(duì)鱗翅目的美國(guó)白蛾和鞘翅目的柳藍(lán)葉甲具有雙抗性，不同轉(zhuǎn)基因株系表

9、現(xiàn)出高中低的抗性水平。pCCA-1、2、5、6、9對(duì)柳藍(lán)葉甲表現(xiàn)高抗，pCCA-3、4、7表現(xiàn)中低抗性。5個(gè)高抗株系的抗性水平明顯比單Bt Cry3Aa基因的3個(gè)高抗株系（pCC-11、53、84）的抗蟲(chóng)性高，用這5個(gè)系號(hào)飼喂的柳藍(lán)葉甲成蟲(chóng)3天時(shí)60％以上死亡，5天時(shí)死亡率達(dá)到85%~100%；而pCC的3個(gè)系號(hào)3天時(shí)死亡率在50%以下，5天時(shí)也只有60%~70%。在對(duì)美國(guó)白蛾的抗性上，有7個(gè)雙Bt株系（pCCA2-7和pCCA9）的抗

10、性水平與pB29表現(xiàn)一致，4齡幼蟲(chóng)在第7~9天時(shí)死亡率達(dá)100%；只有1個(gè)系號(hào)pCCA1對(duì)美國(guó)白蛾表現(xiàn)出了極低的抗性，4齡幼蟲(chóng)在第7天和第9天時(shí)的死亡率分別只有7%和23%。pCC系列不含抗鱗翅目的Bt Cry1Ac基因，對(duì)美國(guó)白蛾未表現(xiàn)抗蟲(chóng)性。
　　6.飼蟲(chóng)結(jié)果還表明無(wú)論是柳藍(lán)葉甲還是美國(guó)白蛾，1齡幼蟲(chóng)對(duì)Bt毒蛋白的耐受性比較差，取食2~3天全部死亡；柳藍(lán)葉甲成蟲(chóng)及美國(guó)白蛾4齡幼蟲(chóng)耐受性明顯增強(qiáng)，取食可延長(zhǎng)到7~11天。通過(guò)對(duì)取

11、食葉片實(shí)時(shí)拍照記錄的取食危害面積來(lái)看，轉(zhuǎn)基因株系同對(duì)照比，即使中低抗株系也能對(duì)葉片起到很好的保護(hù)作用。
　　7.對(duì)美國(guó)白蛾4齡幼蟲(chóng)的總排糞量和體長(zhǎng)調(diào)查表明：低抗株系pCCA1的總排糞量是高抗株系pCCA2-7、pCCA9和pB29的7~23倍，但跟對(duì)照的總排糞量比，只有對(duì)照的25%。從體長(zhǎng)來(lái)看，未轉(zhuǎn)基因741楊上的美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)體長(zhǎng)達(dá)到了19mm， pCCA2-7、pCCA9和pB29的體長(zhǎng)在10~12mm之間，而取食低抗株系pCC

12、A1的最后體長(zhǎng)也只有13mm（為對(duì)照的68%）。從蟲(chóng)糞和體長(zhǎng)這兩個(gè)指標(biāo)分析來(lái)看，充分說(shuō)明了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育起到了明顯的抑制作用。
　　8.采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，以潮霉素做篩選標(biāo)記，用構(gòu)建在同一表達(dá)載體上的雙 Bt基因（Cry3Aa+Cry1Ac）對(duì)巨霸楊進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。實(shí)驗(yàn)對(duì)誘導(dǎo)葉片分化適宜培養(yǎng)基和適宜潮霉素濃度這兩個(gè)影響轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素進(jìn)行了深入研究。確定誘導(dǎo)葉片分化不定芽的最佳培養(yǎng)基為MS+6BA0.25mg·L-1+IBA

13、0.1mg·L-1。通過(guò)潮霉素在0g·L-1~15 mg·L-1范圍內(nèi)不同濃度梯度對(duì)葉片分化和莖尖生長(zhǎng)影響的實(shí)驗(yàn)，確定誘導(dǎo)抗性芽分化的潮霉素臨界篩選濃度為5mg·L-1。經(jīng)過(guò)對(duì)再生抗性芽的多次潮霉素篩選，獲得抗性穩(wěn)定的轉(zhuǎn)雙Bt基因巨霸楊無(wú)性系4個(gè)，編號(hào)為JB1、JB2、JB3和JB4。
　　9.用特異引物分別對(duì)獲得的轉(zhuǎn)雙Bt基因巨霸楊無(wú)性系進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示：JB1、JB2、JB3和JB4均擴(kuò)增得到一條與陽(yáng)性質(zhì)粒作模板PCR