雙Bt基因?qū)顦涞倪z傳轉(zhuǎn)化及外源基因表達研究.pdf

1、為鑒定并篩選出轉(zhuǎn)雙Bt基因741楊對鱗翅目和鞘翅目害蟲同時具有較強抗性的株系，明確聯(lián)合使用兩種或兩種以上的抗蟲基因的抗蟲效果。以8個轉(zhuǎn)三基因雙Bt（Cry3Aa+Cry1Ac+API）741楊株系、1個轉(zhuǎn)雙抗蟲基因（Cry1Ac+API）741楊株系和3個轉(zhuǎn)單抗蟲基因（Cry3Aa）741楊株系為實驗材料，未轉(zhuǎn)基因741楊為對照，進行了外源基因表達測定和抗蟲性對比試驗。同時借助農(nóng)桿菌介導，采用共轉(zhuǎn)化法，用構(gòu)建在同一表達載體pCAMBIA

2、1305-Cry1Ac-Cry3Aa上的雙Bt基因?qū)薨詶钸M行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了4株潮霉素抗性植株。經(jīng)過PCR初步檢測，表明雙Bt基因已經(jīng)整合進了巨霸楊基因組中。主要研究結(jié)果如下：
　　1.轉(zhuǎn)抗蟲基因741楊分別為：單轉(zhuǎn)Bt Cry3Aa基因741楊pCC系列3個株系pCC11、pCC53、pCC84；轉(zhuǎn)雙抗蟲基因（Cry1Ac+API）741楊1個株系pB29；在pB29基礎上通過二次轉(zhuǎn)化法將Cry3Aa基因轉(zhuǎn)入獲得的轉(zhuǎn)三基因雙B

3、t（Cry3Aa+Cry1Ac+API）741楊pCCA系列8個株系pCCA1、pCCA2、pCCA3、pCCA4、pCCA5、pCCA6、pCCA7和pCCA9。對各轉(zhuǎn)基因株系及對照進行組培快繁，篩選確立了誘導741楊分化和生根的適宜培養(yǎng)基。分化培養(yǎng)基為：MS+6BA1.0mg·L-1+NAA0.1mg·L-1；生根培養(yǎng)基為：1/2MS+IBA0.3mg·L-1。
　　2.轉(zhuǎn)雙Bt基因741楊等13個參試材料經(jīng)特異引物PCR擴增

4、Cry1Ac基因和Cry3Aa基因：pB29和轉(zhuǎn)雙Bt基因pCCA系列均擴增得到了Cry1Ac基因特異條帶，對照741和pCC系列基因組未出現(xiàn)擴增條帶。pCC系列和轉(zhuǎn)雙Bt基因pCCA系列均得到了Cry3Aa基因特異條帶，對照741和pB29基因組未出現(xiàn)擴增條帶。說明pB29中Cry1Ac基因和pCC系列中的Cry3Aa基因穩(wěn)定存在。在pB29基礎上，通過二次介導法外源Cry3Aa基因已整合到pCCA各無性系基因組中。
　　3.通

5、過RT-PCR和熒光定量PCR結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平對外源基因的表達進行了檢測。實時熒光監(jiān)測表明：8個雙Bt株系即檢測到了Cry1Ac熒光擴增信號又檢測到了Cry3Aa基因的熒光擴增信號。pCC-11、53、84只有Cry3Aa基因的熒光信號表達，而pB29只有Cry1Ac基因的熒光信號表達，對照741沒有顯現(xiàn)雙Bt基因的熒光擴增信號。根據(jù)測得的Ct值，計算出了各樣品中Cry1Ac基因和Cry3Aa基因在mRNA轉(zhuǎn)錄本中的表達量。雙Bt株系p

6、CCA系列及pB29中Cry1Ac基因的起始表達量在3.26×104~7.50×105之間；雙Bt株系pCCA系列及pCC系列Cry3Aa基因的起始表達量在1.79×108~6.05×109之間。數(shù)據(jù)顯示Cry3Aa基因的起始表達量在108~109數(shù)量級，比Cry1Ac的起始表達量（104~105數(shù)量級）高出了一萬倍。
　　4.用Bt-Cry1Ab/1Ac和Bt-Cry3A ELISA蛋白檢測試劑盒，檢測Cry1Ac蛋白：雙Bt7

7、41楊pCCA系列的8個系號和pB29呈現(xiàn)藍色陽性反應，蛋白含量在16.44~60.32 ng·g-1（FW）；pCC系列和對照741無顯色反應。檢測Cry3Aa蛋白：雙Bt741楊8個系號及pCC系列呈現(xiàn)黃色陽性反應，蛋白含量在2.24~13.30μg·g-1（FW）；pB29和對照741無顯色反應。檢測結(jié)果表明，雙Bt株系能同時表達兩種Bt毒蛋白，單Bt株系也表達了與各自所含基因相應的蛋白。從毒蛋白表達量看Cry3Aa蛋白表達量遠遠

8、高于Cry1Ac蛋白表達量。Cry3Aa蛋白表達量在微克級，Cry1Ac蛋白表達量在納克級。
　　5.用轉(zhuǎn)基因株系新鮮葉片進行柳藍葉甲（Plagiodera versicolora）1~3齡幼蟲和成蟲及美國白蛾（Hyphantria cunea）1齡和4齡幼蟲室內(nèi)飼蟲實驗表明：轉(zhuǎn)入不同抗蟲基因的楊樹對昆蟲的抗性具有選擇性，對非靶標昆蟲沒有毒殺作用。轉(zhuǎn)雙Bt基因741楊對鱗翅目的美國白蛾和鞘翅目的柳藍葉甲具有雙抗性，不同轉(zhuǎn)基因株系表

9、現(xiàn)出高中低的抗性水平。pCCA-1、2、5、6、9對柳藍葉甲表現(xiàn)高抗，pCCA-3、4、7表現(xiàn)中低抗性。5個高抗株系的抗性水平明顯比單Bt Cry3Aa基因的3個高抗株系（pCC-11、53、84）的抗蟲性高，用這5個系號飼喂的柳藍葉甲成蟲3天時60％以上死亡，5天時死亡率達到85%~100%；而pCC的3個系號3天時死亡率在50%以下，5天時也只有60%~70%。在對美國白蛾的抗性上，有7個雙Bt株系（pCCA2-7和pCCA9）的抗

10、性水平與pB29表現(xiàn)一致，4齡幼蟲在第7~9天時死亡率達100%；只有1個系號pCCA1對美國白蛾表現(xiàn)出了極低的抗性，4齡幼蟲在第7天和第9天時的死亡率分別只有7%和23%。pCC系列不含抗鱗翅目的Bt Cry1Ac基因，對美國白蛾未表現(xiàn)抗蟲性。
　　6.飼蟲結(jié)果還表明無論是柳藍葉甲還是美國白蛾，1齡幼蟲對Bt毒蛋白的耐受性比較差，取食2~3天全部死亡；柳藍葉甲成蟲及美國白蛾4齡幼蟲耐受性明顯增強，取食可延長到7~11天。通過對取

11、食葉片實時拍照記錄的取食危害面積來看，轉(zhuǎn)基因株系同對照比，即使中低抗株系也能對葉片起到很好的保護作用。
　　7.對美國白蛾4齡幼蟲的總排糞量和體長調(diào)查表明：低抗株系pCCA1的總排糞量是高抗株系pCCA2-7、pCCA9和pB29的7~23倍，但跟對照的總排糞量比，只有對照的25%。從體長來看，未轉(zhuǎn)基因741楊上的美國白蛾幼蟲體長達到了19mm， pCCA2-7、pCCA9和pB29的體長在10~12mm之間，而取食低抗株系pCC

12、A1的最后體長也只有13mm（為對照的68%）。從蟲糞和體長這兩個指標分析來看，充分說明了轉(zhuǎn)基因植株對昆蟲的生長發(fā)育起到了明顯的抑制作用。
　　8.采用農(nóng)桿菌介導法，以潮霉素做篩選標記，用構(gòu)建在同一表達載體上的雙 Bt基因（Cry3Aa+Cry1Ac）對巨霸楊進行遺傳轉(zhuǎn)化。實驗對誘導葉片分化適宜培養(yǎng)基和適宜潮霉素濃度這兩個影響轉(zhuǎn)化的關鍵因素進行了深入研究。確定誘導葉片分化不定芽的最佳培養(yǎng)基為MS+6BA0.25mg·L-1+IBA

13、0.1mg·L-1。通過潮霉素在0g·L-1~15 mg·L-1范圍內(nèi)不同濃度梯度對葉片分化和莖尖生長影響的實驗，確定誘導抗性芽分化的潮霉素臨界篩選濃度為5mg·L-1。經(jīng)過對再生抗性芽的多次潮霉素篩選，獲得抗性穩(wěn)定的轉(zhuǎn)雙Bt基因巨霸楊無性系4個，編號為JB1、JB2、JB3和JB4。
　　9.用特異引物分別對獲得的轉(zhuǎn)雙Bt基因巨霸楊無性系進行PCR檢測，結(jié)果顯示：JB1、JB2、JB3和JB4均擴增得到一條與陽性質(zhì)粒作模板PCR