轉(zhuǎn)Bt基因毛白楊外源基因橫向轉(zhuǎn)移環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)分析.pdf

1、本試驗(yàn)以8a生轉(zhuǎn)Bt基因敗育毛白楊雄株-D和非轉(zhuǎn)基因的對(duì)照敗育毛白楊雄株-D（Populus tomentosa Stub-D）為試驗(yàn)材料，通過(guò)分離植物體內(nèi)、體外、根際土壤、轉(zhuǎn)Bt基因毛白楊枯落物及其以下不同深度土層中和轉(zhuǎn)Bt基因毛白楊蛀干桑天牛（Apriona germari Hope）排泄物中可培養(yǎng)細(xì)菌和真菌，利用35S啟動(dòng)子和Bt基因兩段基因設(shè)計(jì)特異引物，對(duì)獲得的微生物進(jìn)行轉(zhuǎn)基因毛白楊外源Bt基因PCR檢測(cè)，主要結(jié)果如下：

2、　　 (1)分別用2對(duì)特異引物對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因毛白楊進(jìn)行外源基因PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)14個(gè)系號(hào)的轉(zhuǎn)基因毛白楊均檢測(cè)到外源Bt基因和NptⅡ基因。
　　 (2)分離純化得到真菌307株次，細(xì)菌2526株次。其中從轉(zhuǎn)基因毛白楊根部及根際土壤中分離得到真菌78株次，細(xì)菌95株次，從莖部分離得到真菌24株次，細(xì)菌36株次，從新鮮片分離得到真菌16株次，細(xì)菌25株次；從未轉(zhuǎn)基因的對(duì)照毛白楊根部及根際土壤中分離得到真菌60株次，細(xì)菌39株次，從莖

3、部分離得到真菌16株次，細(xì)菌19株次，從新鮮葉片分離得到真菌22株次，細(xì)菌22株次；從轉(zhuǎn)基因毛白楊枯落物分離得到真菌18株次，細(xì)菌2145株次；從不同深度的土層分離得到真菌33株次，細(xì)菌81株次；從天牛排泄物分離得到真菌39株次，細(xì)菌42株次。
　　 (3)用特異引物對(duì)分離純化得到的真菌和細(xì)菌進(jìn)行外源Bt基因的PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了4株次真菌和7株次細(xì)菌有可穩(wěn)定重復(fù)的PCR陽(yáng)性結(jié)果。具陽(yáng)性結(jié)果的真菌中有1株來(lái)自轉(zhuǎn)基因毛白楊根際土，1

4、株來(lái)自非轉(zhuǎn)基因毛白楊根際土，1株來(lái)自轉(zhuǎn)基因毛白楊種植地的20 cm深土層，1株來(lái)自蛀干桑天牛排泄物；細(xì)菌中有2株來(lái)自轉(zhuǎn)基因毛白楊根內(nèi),2株來(lái)自轉(zhuǎn)基因毛白楊莖面，1株來(lái)自轉(zhuǎn)基因毛白楊莖內(nèi)，1株來(lái)自轉(zhuǎn)基因毛白楊種植地的0 cm土層。
　　 (4)對(duì)具有穩(wěn)定并可重復(fù)的PCR檢測(cè)結(jié)果的菌株，設(shè)計(jì)特異引物，PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA的部分序列，真菌擴(kuò)增28S rDNA D1/D2區(qū)及ITS區(qū)，分別對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，后與GenBank中已

5、知的序列進(jìn)行同源性比較，并結(jié)合形態(tài)特征將未知菌株鑒定到屬。結(jié)果細(xì)菌均屬類芽孢桿菌屬（Paenibacillus），真菌中對(duì)兩個(gè)菌株進(jìn)行了鑒定，分別屬枝孢屬（Fusarium）和鐮刀菌屬（Cladosporium）。
　　 (5)對(duì)從枯落物中發(fā)現(xiàn)的具有穩(wěn)定并可重復(fù)PCR結(jié)果的細(xì)菌菌株的特異擴(kuò)增片段進(jìn)行基因測(cè)序，其序列信息與Bt基因同源性很小,僅為58.34％，排除了PCR反應(yīng)造成的假陽(yáng)性，在轉(zhuǎn)基因毛白楊枯落物的可培養(yǎng)細(xì)菌中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)