Bt抗蟲(chóng)基因?qū)腭R鈴薯的遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、該研究通過(guò)基因工程手段,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Bt基因?qū)腭R鈴薯品種大西洋,同時(shí)對(duì)馬鈴薯品種大西洋、地西瑞、東農(nóng)303和克新4號(hào)的莖段和葉片再生體系進(jìn)行優(yōu)化,建立了馬鈴薯高效再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系,探討了影響植株再生頻率和遺傳轉(zhuǎn)化效率的因素,確立了最佳植株再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化條件,獲得了轉(zhuǎn)基因植株.主要研究結(jié)果如下:1馬鈴薯再生體系的建立(1)莖段最佳愈傷培養(yǎng)基為:MS+0.1 mg/l 2,4-D+1mg/l BA;最佳分化培養(yǎng)基為:MS+

2、1mg/l GA<,3>+1mg/l ZT.葉片最佳愈傷培養(yǎng)基為:MS+0.2mg/NAA+5mg/l GA<,3>+2.25mg/l BA;最佳分化培養(yǎng)基為:MS+5mg/l GA<,3>+2.25mg/l BA.(2)基因型不同,在相同侵染條件下的愈傷誘導(dǎo)率差異較大.大西洋的愈傷率最高,莖段為68.76﹪,葉片達(dá)75.11﹪.(3)以相同的農(nóng)桿菌菌株介導(dǎo)不同類型外植體,外植體分化率不同.該試驗(yàn)采用莖段和葉片作為遺傳轉(zhuǎn)化的外植體材料,

3、最佳外植體為葉片.2遺傳轉(zhuǎn)化影響因素探討(1)莖段外植體最佳預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為2d,此時(shí)抗性愈傷率最高,為56.78﹪.最佳共培養(yǎng)時(shí)間為2d,抗性愈傷率最高為50.10﹪.葉片外植體最佳預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為2d,此時(shí)抗性愈傷率最高,為71.25﹪.最佳共培養(yǎng)時(shí)間為3d,此時(shí)抗性愈傷率最高,為70.00﹪.(2)侵染時(shí)間和菌液濃度因外植體類型而異,莖段外植體最佳侵染時(shí)間為10 min,此時(shí)抗性愈傷率最高,為54.62﹪,菌液濃度OD600=0.5時(shí),抗

4、性愈傷率最高為49.37﹪;(3)殺菌劑選用進(jìn)口頭孢噻肟鈉.濃度為200mg/l時(shí),可完全抑制菌的生長(zhǎng),且對(duì)外植體再生無(wú)影響.(4)抗性選擇劑為卡那霉素(Kan).在不同生長(zhǎng)階段,選擇壓力不同.在愈傷形成階段,Kan的選擇壓力為50mg/l;在生根階段,Kan的選擇壓力為75mg/l.3抗性植株的檢測(cè)試驗(yàn)接種轉(zhuǎn)化101個(gè)葉片,獲得的大西洋再生植株經(jīng)PCR檢測(cè)和PCR-Southern雜交檢測(cè)有3株呈陽(yáng)性,轉(zhuǎn)化率為2.96﹪,初步證明了目