轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲玉米田間試驗與遺傳穩(wěn)定性分析.pdf

1、近20年來，人們采用基因工程手段成功培育了一批抗蟲、抗病、耐除草劑和高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的農(nóng)作物新種質(zhì)，取得了令人矚目的成就。而一個轉(zhuǎn)基因的植株獲得后，通常還要對其后代進行一系列基因純合鑒定、遺傳穩(wěn)定性的研究、農(nóng)藝和經(jīng)濟性狀的篩選、產(chǎn)業(yè)化過程中的種性保持等工作，所有這些過程都需要對目的基因進行跟蹤調(diào)查，需要對大量的轉(zhuǎn)基因后代進行篩選、鑒定。因此在轉(zhuǎn)基因作物研究繼續(xù)深入的同時，科學家們越來越重視轉(zhuǎn)基因與常規(guī)育種技術(shù)的結(jié)合，并加強了對轉(zhuǎn)基因作物后代性狀

2、的大田遺傳表達與變異研究試驗，為利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進行作物種質(zhì)創(chuàng)新，改良現(xiàn)有作物品種，最終實現(xiàn)作物轉(zhuǎn)基因植株從實驗室走向大田生產(chǎn)奠定堅實的基礎(chǔ)。而基因轉(zhuǎn)入宿主后的有效表達及其穩(wěn)定遺傳，則成為轉(zhuǎn)基因植物實用化中的關(guān)鍵問題。
　　 國內(nèi)關(guān)于玉米轉(zhuǎn)Bt基因及Bt玉米遺傳穩(wěn)定性有一些報道，但多數(shù)是在轉(zhuǎn)基因株系的早期世代，以轉(zhuǎn)化植株的性能和基因功能的分析以及對國外Bt玉米的利用效果評價為目的，以國內(nèi)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的基因轉(zhuǎn)化獲得的Bt玉米材料

3、為基礎(chǔ)的鑒定工作不多，尤其是在轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲玉米高代自交系的遺傳穩(wěn)定性的研究還未見報道。
　　 本研究對采用花粉管通道法轉(zhuǎn)crylAh基因抗蟲玉米高代自交系（及其后代）和采用基因槍法獲得的轉(zhuǎn)Bt crylAh和crylIe雙價基因抗蟲玉米植株，通過田間及室內(nèi)玉米螟抗性鑒定，利用PCR、RT-PCR、Southern blot、Western blot、ELISA等各種分子檢測手段對外源基因的遺傳穩(wěn)定性和遺傳規(guī)律等進行了研究分析，

4、獲得的主要研究結(jié)果如下：
　　 1.通過PCR檢測確認了陽性轉(zhuǎn)化植株，用Southern雜交進一步證實了Bt基因已整合到受體植物基因組，用RT-PCR驗證了Bt基因在植物細胞中的轉(zhuǎn)錄，用Western雜交證實了Bt基因在植物細胞中的表達。遺傳分析表明，Bt基因在遺傳傳遞過程中符合孟德爾遺傳規(guī)律，是單位點顯性方式遺傳。外源基因crylAb，crylIe和2mG2-epsps三個外源基因在轉(zhuǎn)基因玉米基因組中完全連鎖，表現(xiàn)為共分離，就

5、像單個基因位點一樣一起傳遞到下一代而沒有分離。
　　 2.CrylAh在同一轉(zhuǎn)基因事件的不同植株間表達量有所不同，但經(jīng)統(tǒng)計分析差異不顯著；在不同轉(zhuǎn)基因事件間的表達量存在顯著差異；同一植株同一發(fā)育時期不同器官CrylAh的表達量不同，苞葉和葉片外源基因蛋白表達量比較高，花粉最低，各組織部位外源基因蛋白表達量順序：苞葉>葉>莖>雄穗>雄穗柄>雌德尖>籽粒>花絲>花粉。Bt殺蟲蛋白在玉米中的表達具有時空特異性，不同生育時期，CrylA

6、h在葉片和莖中的表達量不同，呈動態(tài)下降趨勢。
　　 3.不同的轉(zhuǎn)基因事件與不同常規(guī)玉米自交系進行雜交，雜交后代的外源基因表達量不同，這與親本外源基因表達量高低及另一親本的基因型有很大關(guān)系。要想得到高表達量的雜交后代，則需要選擇外源基因表達量高的轉(zhuǎn)基因自交系做親本；通過玉米螟抗性鑒定和外源基因表達量的測定，表明外源Bt基因通過雌配子的傳遞頻率高于通過雄配子的傳遞頻率，因此盡量選擇抗性親本止向方式進行雜交，這樣獲得表達量高的雜交后代

7、的幾率會高一些。
　　 4.無論是轉(zhuǎn)crylAh單價基因抗蟲玉米自交系及其雜交、回交后代，還是轉(zhuǎn)crylAh和crylIe雙價基因抗蟲玉米經(jīng)連續(xù)四代的田間、室內(nèi)玉米螟抗性檢測，結(jié)果對亞洲玉米螟均表現(xiàn)出很好的抗性，并且這種抗性可以逐代穩(wěn)定遺傳，說明外源Bt基因的導(dǎo)入對防治亞洲玉米螟的危害是有效的。通過ELISA對CrylAh蛋白表達量的檢測，其變化規(guī)律與蟲測結(jié)果基本一致，說明田間、室內(nèi)鑒定與分子鑒定相結(jié)合能更準確地說明Bt殺蟲蛋白

8、對亞洲玉米螟的抗性強弱，進行相關(guān)分析，結(jié)果表明抗蟲玉米CrylAh蛋白表達量與雄穗柄倒折率和室內(nèi)生測7天幼蟲死亡率具有顯著的相關(guān)性，與食葉級別、百株隧道長度具有極顯著的相關(guān)性。說明玉米中Bt蛋白含量的高低是轉(zhuǎn)基因玉米對玉米螟產(chǎn)生抗性強弱的內(nèi)因。
　　 5.轉(zhuǎn)crylAh和crylIe單、雙價基因抗蟲玉米及其后代與受體對照比較，在穗行粒數(shù)及禿尖長上有一定的差異，差異顯著，禿尖變短和穗行粒數(shù)增加表現(xiàn)為產(chǎn)量的提高，而在株高、穗位高、穗

9、長、穗粗、穗行數(shù)及千粒重上差異不大，經(jīng)檢驗差異不顯著。
　　 6.轉(zhuǎn)crylAh基因抗蟲玉米與受體對照比較，除了在栽培地試驗時產(chǎn)量比受體自交系高外，在栽培地、荒地條件下，其出苗率、長勢、株型、生育期、株高等方面均無顯著差異；在荒地條件下，玉米出苗率均很低，撒播處理的出苗率還不到5％；雜草的覆蓋度高于玉米的覆蓋度，存在顯著或極顯著差異，說明玉米的生存競爭能力要遠遠小于雜草；種子發(fā)芽試驗顯示，轉(zhuǎn)crylAh基因抗蟲玉米后代種子發(fā)芽活