寡果糖對人源菌群仔豬腸道菌群結構和宿主代謝的影響.pdf

1、人的胃腸道中定植著一個非常復雜的微生物菌群，其結構和功能與宿主的健康和疾病有非常密切的關系。益生元是一類人不能消化的食物成分，通過被大腸中的細菌發(fā)酵，調節(jié)腸道菌群的結構和代謝，改善宿主健康。寡果糖是一種被普遍應用的益生元，很多研究表明它可以促進雙歧桿菌的生長，但還沒有研究在系統(tǒng)水平上調查寡果糖對腸道菌群的結構和代謝、以及宿主代謝的影響。若直接以人為對象進行研究，存在很多不便，如難以標準化受試者的飲食、采樣困難以及倫理問題；很多研究采用人

2、源菌群(Human Flora-associated，HFA)大鼠/小鼠為模型，并取得大量成果，但嚙齒類動物消化道的解剖和生理特征與人的顯著不同，所得結果有較大的局限性。而豬的消化系統(tǒng)的生理結構與人的相似性很高，更適合構建人腸道菌群的動物模型。因此，本實驗室在前期的工作中建立了HFA仔豬模型，證明人的腸道菌群可以在原本無菌的仔豬腸道內定植。本論文以HFA仔豬為模型，用分子生態(tài)學的方法研究寡果糖對腸道菌群的組成的影響，并用基于核磁共振(N

3、MR)的代謝組學方法調查寡果糖對腸道菌群代謝和宿主代謝的影響。
　　 首先我們建立了針對人腸道菌群中最優(yōu)勢的細菌種群之一——柔嫩梭菌類群的類群特異性PCR-DGGE和克隆文庫的方法。利用一對柔嫩梭菌類群特異性引物擴增得到239 bp的16S rRNA基因片段可以被DGGE很好地分離。11個健康人的糞便柔嫩梭菌類群DGGE圖譜表明此類群的細菌組成具有宿主特異性；用DGGE對一個兒童的糞便柔嫩梭菌類群進行3年的監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)結構在前兩年

4、間有波動，而在第三年保持穩(wěn)定。以一個成人的糞便總DNA為模板，用一個細菌通用的上游引物和一個柔嫩梭菌類群特異性的下游引物擴增1143 bp的16S rRNA基因片段，并克隆建庫，挑取100個克隆。序列分析表明100個克隆均屬于柔嫩梭菌類群；其中64％的克隆來自Faecalibacteriumprausnitzii，6％來自Subdoligranulum variabile，2％是產(chǎn)丁酸細菌A2-207，28％來自未知菌種。通過對比克隆的

5、239 bp片段在DGGE中的遷移位置和DGGE圖譜中條帶的位置，圖譜中絕大多數(shù)條帶的序列得到確定。結果表明柔嫩梭菌類群特異性DGGE和克隆文庫是分析監(jiān)測人腸道菌群中柔嫩梭菌類群的有效方法。
　　 為研究寡果糖對人源腸道菌群結構的影響，我們采集一27歲的健康男性的新鮮糞便樣品制備菌懸液，接種到剖腹產(chǎn)的無菌的仔豬的腸道中，構建了HFA仔豬。10只初生的HFA仔豬被平均分到對照組和益生元組，對照組仔豬食用基本食譜，益生元組仔豬在基本

6、食譜的基礎上每天飼喂一定量的寡果糖，如此持續(xù)至37日齡。在12日齡、17日齡、25日齡和37日齡收集每只仔豬的糞便樣品，并提取糞便總DNA，分別用類群特異性PCR-DGGE和實時定量PCR方法在不同時間點比較兩組仔豬的擬桿菌屬、雙歧桿菌屬和柔嫩梭菌類群的組成和數(shù)量。在四個時間點都沒有觀察到寡果糖對雙歧桿菌的促進作用，這可能是由于本研究中的HFA仔豬腸道中的雙歧桿菌豐度較高，益生元不容易對它們的數(shù)量產(chǎn)生顯著的提高作用。但寡果糖主要影響了其

7、他細菌：在12日齡，兩種未知擬桿菌的水平被提高；25日齡，寡果糖提高了Subdoligranulum variabile的水平，抑制了屬于柔嫩梭菌類群的一種未知細菌；37日齡，擬桿菌屬的數(shù)量被寡果糖顯著降低。此工作表明，寡果糖可以影響雙歧桿菌之外的腸道細菌。我們發(fā)現(xiàn)寡果糖可以刺激S.variabile的生長，已經(jīng)有研究證明此細菌具有重要的生理功能，所以在今后的工作中有必要將它分離出來并進行功能分析，研究它與益生元和人體健康之間的關系。<

8、br>　　 接著，我們用基于NMR的代謝組學方法比較了HFA仔豬大腸不同區(qū)域內容物的代謝物組成，研究了大腸內菌群代謝的空間分布規(guī)律。用1H NMR圖譜技術展示了10只37日齡的HFA仔豬的盲腸、近端結腸、遠端結腸內容物和糞便中的生化組成，發(fā)現(xiàn)不同部位包含的代謝物種類相似，有很多細菌的代謝物，如短鏈脂肪酸、有機酸、酚酸、甲胺類物質、各種氨基酸等；也有來自食物、宿主分泌或來源尚未確定的物質，如碳水化合物、膽汁酸和核酸堿基。用多變量統(tǒng)計方法

9、，主成分分析(Principle Component Analysis，PCA)、偏小二乘法(PartialLeast Square Discrimination Analysis，PLS-DA)和正交偏小二乘法(Orthogonal Projection on Latent Structure，O-PLS)區(qū)分大腸不同區(qū)域的內容物和糞便的代謝物圖譜，發(fā)現(xiàn)短鏈脂肪酸的含量從盲腸開始延大腸直至糞便逐漸降低，苯乙酸和3-羥基苯丙酸的含量在盲

10、腸和近端結腸中明顯高于遠端結腸和糞便，支鏈氨基酸的含量從盲腸到糞便依次升高，糖苷類大分子的相對含量從盲腸到遠端結腸逐漸升高。本研究表明，由于大腸不同部位的生理生態(tài)狀況不同，腸道菌群的代謝活動也有差異。HFA仔豬大腸不同區(qū)段的內容物中代謝物的變化與文獻報道的人類大腸內容物的生化組成的變化趨勢相似，所以有潛力成為研究人腸道菌群代謝的有力模型。基于NMR的代謝組學方法可以快速展現(xiàn)腸道內容物的代謝物組成，反映腸道菌群代謝活動的概貌，可以用于監(jiān)測

11、腸道菌群的活動，研究外來干預(如益生元、益生素等)對菌群代謝的影響。糞便中的代謝物組成不完全等同于大腸內容物的情況，所以在下一步研究益生元對腸道菌群代謝的影響時，需要分析結腸內容物中的代謝物組成的變化。
　　 為研究寡果糖對腸道菌群和宿主代謝的影響，5只對照組和5只益生元組仔豬在12日齡、17日齡、25日齡和37日齡的糞便，以及37日齡的近端結腸內容物、遠端結腸內容物和尿液被采集。用NMR展示這些樣品的生化組成，用正交偏小二乘法

12、(Orthogonal Projection onLatent Structure，O-PLS)比較兩組仔豬的NMR圖譜。在4個時間點兩組仔豬糞便的生化組成沒有顯著區(qū)別。在37日齡，益生元組仔豬的近端結腸內容物中含有較高含量的低聚糖、葡萄糖、乙酸、丙酸和核酸堿基；但寡果糖主要影響了HFA仔豬遠端結腸內容物的代謝物組成，提高了低聚糖、葡萄糖、乙酸、乳酸、核酸堿基和多種氨基酸的含量，降低了膽汁酸的含量；益生元組仔豬的尿液中含有較高水平的丙氨

13、酸、甘氨酸、肌酸、磷酸肌酸、乳酸、檸檬酸，但尿囊素和尿素的含量較低，一些由腸道菌群或者由腸道菌群和宿主共代謝產(chǎn)生的代謝物，如二甲胺、苯乙酰甘氨酸、三甲胺、三甲胺氧化物、馬尿酸和4-羥苯基乳酸的含量在兩組仔豬尿液中有差異。從這些代謝變化推斷，寡果糖主要在HFA仔豬遠端結腸內發(fā)揮益生元功效：寡果糖被結腸菌群發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸，從而影響了宿主的能量代謝；寡果糖調節(jié)菌群對氨基酸的代謝，影響了宿主的氨基酸代謝，改善宿主機體的氮平衡。寡果糖降低結腸